Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Որոշ բակտերիաների ԱԵՖ-ազային ակտիվության բնութագրումը գլիցերոլի և գլյուկոզի օքսիդացման պայմաններում

Բլբուլյան, Սյուզաննա Սուրենի (2019) Որոշ բակտերիաների ԱԵՖ-ազային ակտիվության բնութագրումը գլիցերոլի և գլյուկոզի օքսիդացման պայմաններում. PhD thesis, ԵՊՀ.

[img] PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (5Mb)
    [img]
    Preview
    PDF (Thesis)
    Available under License Creative Commons Attribution.

    Download (2305Kb) | Preview

      Abstract

      Metabolism of all living organisms, including bacteria, depends on the environment, energy sources and other factors. Escherichia coli (E. colt) can ferment different carbohydrates, such as glucose and as a result of which are formed various organic acids (succinic acid, acetic acid, formic acid, lactic acid and etc.), ethanol and gases (carbon dioxide (C02), hydrogen (H2)). That's why these bacteria are widely used for industrial purposes for the production of bioethanol, bio-hydrogen. At the same time, the issue of finding inexpensive and easily accessible carbon sources is also topical. In 2006, it has been discovered that E. coli implements glycerol fermentation, resulting in different organic acids, gases, and alcohols are formed also (Dharmadi et al., 2006; Gonzalez et al., 2008). Glycerol is the most common waste of biodiesel production, which makes it quite affordable, and its' fermentation is very promising for bio-hydrogen and bio-ethanol production (Chaudhary, 2012). Formic acid, formed during fermentation in E. coli, oxidazes up to C02 and H2 by the membrane-bound enzyme complex - formate hydrogen lyase (FHL). H2 is ecologically clean, renewable source of fuel from which burning ֊ 140 kj/g energy is released (Chu and Majumdar, 2012). Different bacteria are producing H2 during dark- or photo-fermentation (Trchounian, 2015; Hallenbeck and Liu, 2016). Special enzymes named hydrogenases (Hyd) are involved in this process. It has been shown that upon glucose fermentation for Hyds and FHL activities, their energetics requirements is necessary the H+-translocating F0FrATPase, which is the essential membrane mechanism generating proton motive force (Ap) (Blbulyan et al., 2011, Trchounian et al., 2013). Studies in our laboratory have shown that production of H2 and H+ efflux are sensitive to N,N -dicyclohexylcarbodiimide (DCCD) - inhibitor of F0F, (Trchounian and Sawers, 2014, Blbulyan & Trchounian, 2015): On the other hand, it has been shown that ATPase activity of membrane vesicles F0F1 was significantly enhanced by formate when bacteria were grown during glucose fermentation (Bagramyan and Trchounian, 2003). How can explain the such importance of FqF,? Perhaps, during fermentation, ATPase combines hydrolysis of ATP with H+ transfer across the membrane, as a result of which energy of ATP converts to Ap, required for the functioning of FHL and Hyds (Trchounian and Sawers, 2014) However, during glycerol fermentation, the data on the cooperation and interaction mechanisms of the above mentioned enzymes are limited. The role of F0F, in oxidation-reduction (redox) sensing by bacteria under glucose or glycerol fermentation has been proposed (Kirakosyan & Trhounian, 2007; Vassilian & Trchounian, 2009). However, the pathways and mechanisms involved in redox sensing by bacteria and the regulation of the bacterial metabolism are still not clear for many bacteria and are completely unknown for others, especially for thermophiles (Geobacilli) (Ghazaryan etal., 2015). Research topics and tasks. The main purpose of this study was to investigate the ATPase activity of various bacteria depending on the carbon source oxidation nature. Constituted tasks of the research were to: investigate the membrane vesicles ATPase activity of E. coli BW25113 wild type and different Hyds lacking mutants during glycerol fermentation; study of ATPase activity changes in E. coli wild type and various Hyd mutants membrane vesicles upon mixed carbon (glucose and glycerol) fermentation and compare with alone glycerol fermentation; determine changes of H+/K+fluxes in the cell extracts upon glycerol fermentation investigate influence of different concentration of glucose on E. coli and Hyd mutant ATPase activity; reveal the growth, kinetics of oxidation-reduction potential (ORP, Eh), pH changes and ATPase activity of thermophile Geobacillus toebii (G. toebii) ArzA-8strain. Scientific novelty and practical value of the study. Within the frames of the conducted work it has been revealed that pH of medium influence on E. coli F0F, activity upon glycerol fermentation, in addition the highest activity, was observed at pH 7.5. Hyd-1 and Hyd-2 are required for the F0Fr ATPase activity. It has been discovered that F0F, is involved in formation of H2 cycle across the membrane and operates as an internal pH adjuster. It has been also shown that functional link between F0F, and secondary transport systems like TrkA depends on glucose concentration and external pH. Obtained results point out the nature of interaction between TrkA and FqF, and the importance of this during fermentation. For the first time in this investigation, it has been shown that regulation of ORP can increase the biotechnological applicability of thermophiles for obtaining both biomass and various valuable products. These findings are absolutely novel for these bacteria and provide an opportunity to clarify the functional relationship of different Hyds and H+-ATPase in conditions of fermentation of different carbon sources as well as the role of ATPase in cell metabolism regulation. Various strains of E. coli have a great biotechnological potential and are widely used for biofuels production. Consequently, obtained data about different enzymes interaction mechanisms, functional link and regulation, can be used for both basic scientific research and biotechnological purposes. Main points to present at the defense. E. coli Hyd-1 and Hyd-2 enzymes directly interacts with F0FrATPase or transfer H+ across the membrane upon glycerol fermentation, at slightly alkaline pH (pH ATPase activity of membrane vesicles of E. coli depends on the medium pH under glycerol fermentation. Nature of functional link between ATPase and Hyds depending on fermentation substrate is different. E. coli ATPase activity and its interaction with Hyd-4, depend on the glucose concentration and the medium pH. The growth and the ATPase activity of G. toebii ArzA-8 strain depend on presence of carbon source and environmental redox state. Work approbation. Main results of the dissertation were discussed at seminars in Department of Biochemistry, Microbiology and Biotechnology, Biology Faculty of Yerevan State University, and at scientific conferences: Հւսնգույցւսյին բառեր Escherichia coli, Geobacillus toebii, ԱԵՖ-ազային ակտիվություն, գյիցերոլի և գլյուկոզի խմորում, հիդրոգենազներ (Հիդ), H+-K+- ական փոխանակություն, օքսիդավերականգնողական պոտենցիալ: Աղիքային ցուպիկում (E. coli) խմորման ընթացքում առաջացած մրջնաթթուն թաղանթակապ մրջնաթթու-ջրածին-լիազ (ՄԶԱ) ֆերմենտային համալիրի միջոցով օքսիդանում է մինչև ածխաթթու գազի (C02) և մոլեկուլային ջրածնի (H2): Այս գործընթացում ընդգրկված հատուկ ֆերմենտների հիդրոգենագների էներգետիկ պահանջների համար անհրաժեշտ է էներգիաապահովման տեսանկյունից կարևորագույն ֆերմենտի պրոտոնային F^-ԱԵՖ-ագի գործունեությունը (Bagramyan and Trchounian, 2003): Ներկայացված աշխատանքում առաջին անգամ ուսումնասիրվել է գլիցերոլի խմորման պայմաններում E. coli-ի ԱԵՖ-ազային ակտիվության առանձնահատկությունները, ինչպես նաև փորձ է արվել բացատրել պրոտոնային ԱԵՖ-ագի և հիդրոգենագների գործառական կապը խմորման և pH-ի տարբեր արժեքների պայմաններում: Ուսումնասիրվել է նաև ջերմասեր G. toebii ArzA-8 տեսակի աճը, օքսիդավերականգնողական պոտենցիալի (ՕՎՊ) կինետիկան և pH-ի փոփոխությունները, ինչպես նաև պրոտոնի տեղափոխությունն ամբողջական բջիջներում ' օքսիդիչի և վերականգնիչի առկայության պայմաններում: Այդ համատեքստում ջերմասեր G. Toebii-\\ վերոհիշյալ ֆիզիոլոգիական գործընթացները համեմատվել են մեզոֆիլ E.coli-\) հետ: Յույց է տրվել, որ գլիցերոլի խմորման պայմաններում միջավայրի pH-ն ազդում է E. coli բակտերիաների F0FгԱԵՖ-шզի ակտիվության վրա, ընդ որում ամենաբարձր ակտիվություն դիտվել է pH 7.5-ում: Գլիցերոլի խմորում իրականացրած E. coli-ի BW25113 նախնու թաղանթային բշտիկների ԱԵՖ-ազային ակտիվությունը' համեմատած գլյուկոզի խմորման հետ, ցածր է գրեթե երկու անգամ: Այս ակտիվությունը զգալիորեն ճնշվում է F0F^ արգելակիչ N,N’- դիցիկլոհեքսիլկարբոդիիմիդի (0.2 մՄ ԴՏԿԴ)-ի ազդեցությամբ pH 7.5-ում: hyaB և hybC մուտւսնւոների (բացակայում են, համապատասխանաբար, Հիդ-1-ի և Հիդ-2-ի մեծ ենթամիավորները) ընդհանուր և ԴՑԿԳ-զգայուն ցածր ԱԵՖ- ազային ակտիվության տվյալները թույլ են տվել ենթադրել, որ վերոհիշյալ պայմաններում' Հիդ-2-ը ավելին, քան Հիդ-1-ը, ունի ամուր փոխազդեցություն F0F1-ԱԵՖ-шզի հետ: Ստացված տվյալները վկայում են, թույլ թթվային pH-ի (5.5) և գլիցերոլի խմորման պայմաններում, F^-ԱԵՖ-ւսզի և ՄԶԼ, համալիրի գործառական կապի մասին: Ուսումնասիրվել է նաև E. coli-\\ վայրի տիպի և նրա Հիդային մուտանտների ԱԵՖ-ազային ակտիվությունը ածխածնի խառն աղբյուրների' գյուկոզի և գլիցերոլի խմորման պայմաններում, pH-ի 7.5, 6.5 և 5.5 արժեքների դեպքում: Բոլոր շտամները խմորման այս պայմաններում և pH-ի վերոհիշյալ արժեքների դեպքում, ցուցաբերել են ավելի բարձր ԱԵՖ-ազային ակտիվություն' քան միայն գլիցերոլի խմորման դեպքում: Ընդհանրացնելով ստացված արդյունքները' կարելի է եզրակացնել, որ £ co/Ւի ԱԵՖ-ազային ակտիության և աճման միջավայրի pH-ի միջև կա ուդիդ կապ: Գլիցերոլի խմորման պայմաններում հիմնային pH-ը առավել օպտիմալ է Դ-ՑԿԴ-զգայուն ԱԵՖ-ազային ակտիվության համար: Ուսումնասիրվել է F0FгԱԵՖ-шզի և երկրորդային տեղափոխիչ համակարգի' TrkA-ի,գործառական կապը գլյուկոզի տարբեր կոնցենտրացիաների և արտաքին pH-ի տարբեր արժեքների պայմաններում: Յույց է տրվել, որ F0Fr TrkA գերհամալիրը ձևավորվում է գլյուկոզի ցածր կոնցենտրացիայի խմորման պայմաններում, հիմնային pH-ում: Հայտնի է, որ բնության մեջ, որտեղ սահմանափակ են մանրէների աճի պայմանները, ջերմասերները' իրենց մենահատուկ ֆերմենտներով ցուցաբերում են տարբեր նյութավտխանակւսյին ուղիներ: Ածխածնի աղբյուրի (գյուկոզ) առկայությունից կախված, G. toebii բակտերիայի ՕՎՊ-ի և pH-ի կինետիկայում ստացվել են զգալի տարբերություններ: Գլյուկոզի ներկայությամբ աճի ընթացքում դիտվում է միջավայրի թթվեցում և ՕՎՊ-ի դրական արժեք, մինչդեռ գլյուկոզի բացակայությամբ, երբ միջավայրը հիմնայնացվում է, գրանցվում են ՕՎՊ-ի ցածր բացասական արժեքներ Հետաքրքրական է, որ G. toebii-\) ԱԵՖ-ազային ակտիվությունը բավականին բարձր էր: Ստացված արդյունքները ցույց են տալիս F0F1-ԱԵՖ- սինթազի դերը այս բակտերիայի ֆիզիոլոգիական և էկոլոգիական գործընթացներում, մասնավորապես ռեդօքս զգայնության մեջ: Հնարավոր է, որ բակտերիայի աճի ընթացքում ռեդօքս ռեագենտների ցուցաբերած ազդեցությունները պայմանավորված են հենց F^-ԱԵՖ-սինթազով: Հարկ է նշել, որ G.toebii-ի համար ստացված տվյալները լիովին տարբերվում էին £ շօ//-ի համար ստացված տվյալներից: Կատարված հետազոտությունները թույլ են տայիս պարզաբանել F^-ի և Հիդ-ների, ինչպես նաև երկրորդային տեղափոխիչ համակարգերի գործառական կապը, փոխազդեցությունը, վերջինիս բնույթը տարբեր սուբստրատների խմորման պայմաններում և pH-ի տարբեր արժեքներում: Ստացված տվյալները կխորացնեն վերոհիշյալ համակարգերի մասին ունեցած պատկերացումները: Հաշվի առնելով G.toebii-ի ցուցաբերած արդյունքները, կարելի է ասել, որ ՕՎՊ-ի կարգավորումը, կարող է մեծացնել ջերմասեր բատերիաների կենսատեխնոլոգիական կիրառելիությունը, ինչպես կենսազանգվածի, այնպես էլ տարբեր արժեքավոր նյութերի ստացման նպատակով: Муравьиная кислота, образующаяся в кишечной палочке (Е. coli) в процессе брожения, окисляется посредством формиат-водород-лиазного комплекса (ФВЛ) с образованием углекислого газа (С02) и молекулярного водорода (Н2). Для энергетических затрат, вовлеченных в данный процесс ферментов - гидрогеназ, необходимо участие другого важнейшего фермента - протонной Г0ЕгАТФазы (Bagramyan and Trchounian, 2003). В представленной работе впервые исследованы особенности АТФазной активности Е. coli в условиях сбраживания глицерина, а также сделана попытка выявления функциональной связи между протонной АТФазой и гидрогеназами при различных значениях pH среды. Исследованы также рост, кинетика окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) и изменения pH среды, перенос протона в присутствии окислителя и восстановителя в термофильной бактерии G. toebii ArzA-8. При этом перечисленные физиологические процессы в термофильной G. toebii сравнивались с мезофильной Е. coli. Показано, что при сбраживании глицерина, pH среды влияет на активность протонной Р0РгАТФазы E.coli, при этом наиболее высокая активность проявляется при pH 7.5. АТФазная активность мембранных везикул Е. coli BW25113 при сбраживании глицерина была ниже почти в 2 раза, по сравнению с активностью при сбраживании глюкозы. Активность значительно подавлялась в присутствии ингибитора FoFi-АТФазы - N,N’- дициклогексилкарбодиимида (0.2 мМ ДЦКД) при pH 7.5. В hyaB и hybC мутантах (отсутствуют большие субъединицы Гид-1 и Гид-2, соответственно) общая и низкая ДЦКД-чувствительная АТФазные активности позволяют предположить, что в данных условиях Гид-2 сильнее взаимодействует с F0Fr АТФазой, чем Гид-1. Полученные данные свидетельствуют о наличии функциональной связи между FoFrAT0a3OH и ФВЛ комплексом при слабокислом pH (5.5) и сбраживании глицерина. Исследованы также АТФазные активности дикого вида Е. coli и Гид-ых мутантов при сбраживании смешанных источников углерода - глюкозы и глицерина, при pH 7.5, 6.5 и 5.5. При этом все штаммы при данных значениях pH обладали более высокой АТФазной активностью, по сравнению с глицерином. Обобщая полученные результаты, можно предположить существование прямой связи между АТФазной активностью Е. соИ и pH среды роста.

      Item Type: Thesis (PhD)
      Additional Information: Որոշ բակտերիաների ԱԵՖ-ազային ակտիվության բնութագրումը գլիցերոլի և գլյուկոզի օքսիդացման պայմաններում: Характеристика атфазной активности некоторых бактерий в условиях окисления глицерина и глюкозы.
      Uncontrolled Keywords: Բլբուլյան Սյուզաննա Սուրենի, Блбулян Сюзанна Суреновна
      Subjects: Biology
      Divisions: UNSPECIFIED
      Depositing User: NLA Circ. Dpt.
      Date Deposited: 27 Nov 2019 12:30
      Last Modified: 30 Jan 2020 12:58
      URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/10780

      Actions (login required)

      View Item