Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Էֆեդրայի տեսակների, դրանց երկրորդային մետաբոլիտների ուսումնասիրությունը in vitro մշակույթում և կենսատեխնոլոգիայի մշակումը

Փարսաեիմեհր, Ալի Հասսանի (2011) Էֆեդրայի տեսակների, դրանց երկրորդային մետաբոլիտների ուսումնասիրությունը in vitro մշակույթում և կենսատեխնոլոգիայի մշակումը. PhD thesis, ՀՀ ԳԱԱ §Հայկենսատեխնոլոգիա¦ ԳԱԿ ՊՈԱԿ.

[img] PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (731Kb)

    Abstract

    Потенциальная возможность изолированных клеток высших растений синтезировать полезные метаболиты была выявлена еще в 1950-ых годах. С того времени для широкомасштабной культивации клеток и продукции ими вторичных метаболитов была разработана техника создания культуры клеток. Очевидно, что будущее биотехнологии в этой области базируется на разработках технологий, позволяющих индуцировать генетические варианты, получать конкретные вторичные метаболиты в нужном количестве и создавать системы культур в соответствии с уникальными требованиями для роста клеток растений (Caretto et al, 2010). Ephedra (E.) происходит из рода голосеменных, единственного рода в семействе Ephedraceae и порядка Ephedrales, представленного в качестве лекарственного растения (Konar and Singh, 1979). По современным представлениям это удивительное растение используется во всем мире для решения многих медицинских проблем, начиная с простуды и простой лихорадки и заканчивая бронхиальной астмой и сенной лихорадкой. Компоненты этого растения, такие как протоалкалоиды (эфедрин, псевдоэфедрин), таннин, сапонины, флавоны, летучие масла были в круге интересов исследователей благодаря своей потенциальной ценности в фармацевтической области (De-Zhi et al, 2004). Целью данного исследования явилось: получить каллус из трех видов Ephedra (Ephedra procera Fisch et C. A. Mey, Ephedra strobilacea Bunge, Ephedra pachyclada Boiss) в оптимальном диапазоне и найти единственно подходящий для его применения в суспензионной культуре метод, а также и исследовать вторичные метаболиты в in vitro культуре и определить оптимальные условия для ее роста и синтезирования вторичных метаболитов. получение каллуса и суспензионной культуры из E. procera, E. strobilacea, E. pachyclada; изучение и определение роста каллуса в различном гормональном диапазоне; проведение сравнительного анализа антимикробныx и антиоксидантныx свойств вторичных метаболитов каллуса и материнского растения; проведение сравнительного анализа каллуса и материнского растения по содержанию в них общего фенола; определение влияния L-фенилаланина на продукцию эфедрина и псевдоэфедрина, в суспензионной культуре E. procera; роста клеток E. procera в суспензионной культуре и корреляции биосинтеза эфедрина и псевдоэфедрина с pH и параметрами роста под влиянием L-фенилаланина в различном диапазоне (2.5; 5.0; 7.5; 12.5 мМ); определение подходящего диапазона для применения L-фенилаланина в суспензионной культуре E. procera; определение содержания эфедрина и псевдоэфедрина в материнских растениях трех выбранных видов; создание калибровочной кривой в диапазоне 19-200 мкг/мл для определения концентрации эфедрина и псевдоэфедрина. Научная новизна Впервые в Иране проведены следующие исследования: изолированы культуры у видов Ephedra (E. procera, E. strobilacea, E. pachyclada); установлено взаимосвязь между применяемыми фитогормонами и каллусной индукцией, каллусной биомассой, синтезом эфедрина и псевдоэфедрина и накоплением хлорофилла; определена антимикробная активность каллуса и материнского растения против грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов; установлена антиоксидантная активность каллуса и материнского растения; установлено количество L-фенилаланина, способствующее синтезу эфедрина и псевдоэфедрина в суспензионной культуре E. procera. Нами разработана подходящая среда для роста клеток Ephedra и продуцирования эфедрина и псевдоэфедрина. Наши анализы четко указывают на антимикробные и антиоксидантные свойства Ephedra (полученных клеточных культур и диких растений). Таким образом, в данной работе определены и представлены питательные среды, соответствующие для роста клеток E. procera и продуцирования ими эфедрина и псевдоэфедрина. С другой стороны, эта работа четко представляет практическое направление для промышленной деятельности с экономической значимостью, учитывая тот факт, что эфедрин и псевдоэфедрин, будучи вторичными метаболитами, не требуют особых затрат для своего продуцирования, имеют очень широкое применение в фармацевтической промышленности. Ատենախոսությունը նվիրված է մեծ պահանջարկ ունեցող դեղաբույս Ephedra L. (E.) ուսումնասիրությանը, որը օժտված է բարձր մետաբոլիկ ակտիվությամբ և գնահատվում է հատկապես էֆեդրինի և պսևդոէֆեդրինի պարունակության շնորհիվ: Աշխատանքի հիմնական նպատակն է եղել Իրանի կենտրոնական շրջաններում աճող Ephedra 3 վայրի տեսակների` E.strobilacea Bunge, E. procera Fisch et C. A. Mey, E. pachyclada Boiss, կալլուսային, իսկ E. procera կախույթային կուլտուրայի աճեցումը ժամանակակից մեթոդների կիրառմամբ, երկրորդային մետաբոլիզմի ուսումնասիրությունը մեկուսացված կուլտուրայում, օպտիմալ պայմանների ընտրությունը բջիջների աճի և երկրորդային մետաբոլիտների կենսասինթեզի համար: Իրականացվել է կալլուսի ինդուկցիա ՄՍ սննդամիջավայրում, որոշվել է 3 տեսակների Ephedra բջիջների աճման ակտիվությունը տարբեր հորմոնալ նյութերի և խտությունների դեպքում: Բնութագրվել են Ephedra կալլուսի տեսակները և ընտրվել է համապատասխան կալլուս կախույթային կուլտուրայում աճեցման նպատակով: Պարզվել է, որ E. Procera մյուս տեսակների համեմատ ցուցաբերել է բջիջների աճի և կուտակման ամենաբարձր ակտիվույթուն in vitro մշակույթում: Աճեցվել է կախույթային կուլտուրա E. Procera տեսակից: Հաստատուն աճող կալլուսային և կախույթային կուլտուրաներում որոշվել է կալլուսային հյուսվածքների կենսասինթետիկ հնարավորությունը և ակտիվության բարձրացումը տարբեր հորմոնալ նյութերի և խտությունների դեպքում: Հաստատվել է, որ ԲԱՊ-ի համեմատ կինետինի (կին.) օգտագործումը, որպես ցիտոկինին ավելի նպատակահարմար է կալլուսային կուլտուրայիում էֆեդրինի և պսևդոէֆեդրինի սինթեզի համար: Ճշտվել է մեկուսացված կուլտուրայում Ephedra յուրաքանչյուր տեսակի բջիջների կենսունակության պահպանման համապատասխան հորմոնալ միջավայրը` ՆՔԹ/կին. (մգ/լ) Ephedra strobilacea -1.5 : 1.0, Ephedra procera - 2.0 : 1.0, Ephedra pachyclada - 2.0 : 0.5: Դիտվել է արմատառաջացման 18%, կալլուսի 4-րդ վերատնկումից հետո, սննդամիջավայրում ՆՔԹ/կին. (մգ/լ) 2.0:1.0 խտության դեպքում: Պարզվել է, որ կինետինով մշակումը հանգեցնում է բջջային զանգվածի առավելագույն աճի, որը և բերում է էֆեդրինի 108.1±0.6 մկգ/գ և պսևդոէֆեդրինի 730.3±1.0 մկգ/գ չոր զանգված, ինչպես նաև ընդհանուր քլորոֆիլի պարունակության 118.4±7.6 մկգ/մգ չոր զանգված աճի: Հայտնաբերվել է փոխադարձ կապ սննդամիջավայրի աուքսինի խտության ավելացման, կալլուսի ինդուկցիայի արագության և ժամանակի միջև: Պարզվել է, որ ՆՔԹ-ի 2.0 մգ/լ առկայության դեպքում կալլուսի ինդուկցիայի արագացումը բերում է ինդուկցիայի ժամանակի կրճատման: Հայտնաբերվել է Ephedra բոլոր նշված տեսակների վայրի բույսերի և կալլուսային կուլտուրաների մեթանոլային էքստրակտների հակամիկրոբային ակտիվություն գրամդրական, գրամբացասական բակտերիաների և սնկերի նկատմամբ, որը վայրի բույսերում բարձր է եղել կալլուսի համեմատ: Պարզվել է, որ հետազոտված Ephedra 3 տեսակները ցուցաբերել են առավելագույն հակամիկրոբային ակտիվություն Pseudomonas aeuroginosa նկատմամբ: Որոշվել է Էքստրակտների հակաօքսիդանտային հատկությունը և պարզվել, որ E. strobilacea 1.61±0.08 մմոլ էկվ կվերցետին/գ էքստրակտ չափաքանակով վայրի բույսի և 0.278±0.02 մմոլ էկվ կվերցետին/գ էքստրակտ չափաքանակով կալլուսի համար ցուցաբերել է առավելագույն արդյունք: Հայտնաբերվել է ֆենոլի պարունակություն Ephedra բոլոր ուսումնասիրված տեսակներում, ընդ որում E. strobilacea ֆենոլի առավելագույն քանակ` վայրի բույսի դեպքում` 504.9±41.51 մկմոլ էկվ կատեխին/գ էքստրակտ և կալլուսի դեպքում` 114.61±15.13 մկմոլ էկվ կատեխին/գ էքստրակտ: Կատարվել է L-ֆենիլալանինի ազդեցության ուսումնասիրություն E. procera բջջային աճի, նրանցում էֆեդրինի և պսևդոէֆեդրինի պարունակության վերաբերյալ կախույթային կուլտուրայում: Որոշվել է E. procera կախույթային կուլտուրայում, L-ֆենիլալանինի տարբեր խտություններում կորրելացիոն կապը էֆեդրինի, պսևդոէֆեդրինի և բույսի աճման կարգավորիչների միջև: Պարզվել է, որ կախույթային կուլտուրայում էֆեդրինի և պսևդոէֆեդրինի (համապատասխանաբար 112.77±0.54 մկգ/գ և 588.68 ±1.84 մկգ/գ չոր զանգված) առավելագույն պարունակություն գրանցվում է 12-րդ օրը 7.5 մմոլ L-ֆենիլալանինի ազդեցության պայմաններում: Ստացված արդյունքների հիման վրա առաջարկվում է մշակված կենսատեխնոլոգիայի ներդրում` կենսառեակտորներում էֆեդրինի և պսևդոէֆեդրինի արտադրության նպատակով: Ephedra, callus, in vitro, suspension culture, MS medium, ephedrine, pseudoephedrine, NAA, kinetin, BAP Investigations were carried out to analyse demanded medicinal plant Ephedra, wհich has highly metabolic activity and valuable for ephedrine and pseudoephedrine production. The main purpose of the work was arranged base using new methods to induce callus of 3 species of Ephedra (Ephedra strobilacea Bunge, Ephedra procera Fisch et C. A. Mey, Ephedra pachyclada Boiss) grown in the central part of Iran, to conduct suspension culture of E. Procera, to investigate the secondary metabolism in isolated culture, to choose the optimal conditions for cell growth and biosynthesis of secondary metabolites. Callus induction was performed on MS medium and cell growth of three species of Ephedra in different hormonal ranges had been determined. Callus from Ephedra species were characterized and the suitable callus was chosen to be grown in suspension culture. It was found out that E. procera compared with the other species had recorded the highest cell growth and accumulation in in vitro culture. In the stable growing callus and suspension culture cells were analyzed for their biosynthetic ability and probably promoted activity of callus under different hormones and hormonal ranges. It was found out that Kin as a cytokinin was more suitable than BAP for callus induction and ephedrine and pseudoephedrine production. The hormonal range for cell growth of every Ephedra species was determined as follow NAA/Kin (mgl-1) Ephedra strobilacea 1.5:1.0, Ephedra procera 2.0:1.0 and Ephedra pachyclada 2.0:0.5. After 4th subculture in the 18% of the treatments on the medium contained NAA/Kin (mgl-1) 2.0:1.0 rhizogenesis occurred. It was found out that cultures where Kin had been used the highest cell biomass were recorded with production of 108.1 ± 0.6 μg g-1 dry weight ephedrine and 730.3 ± 1.0 μg g-1 dry weight pseudoephedrine and total chlorophyll content 118.4 ± 7.6 μg mg-1 dry weight. There is a correlation between time and callus induction rate as by increasing the NAA to 2.0 mg/l the callus induction rate increased and callus induction time significantly decreased. All methanolic extracts of mentioned Ephedra species in wild plants and callus showed antimicrobial activity against gram negative, gram positive bacteria and also fungi, but antimicrobial activity of the wild plants was determined higher compared with callus. The 3 investigated Ephedra species showed the highest antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa. The experiments were carried out to determine the antioxidant activity of extracts and considerably E. strobilacea showed the highest results 1.61 ± 0.08 mmol eq quercetin/g extract for wild plant and 0.278 ± 0.02 mmol eq quercetin/g extract for callus. In addition, all Ephedra species had phenol contents but E. strobilacea recorded the highest amount 504.9 ± 41.51 μmol eq catechin/g extracts for wild plants and 114.61 ± 15.13 μmol eq catechin/g extracts for callus. Another study was conducted to analyze the influence of L-phenylalanine on cell growth and ephedrine and pseudoephedrine production in suspension culture for E. procera. And also a correlated connection was determined among L-phenylalanine ranges and ephedrine, pseudoephedrine and plant growth regulators. As a result the highest amount of ephedrine and pseudoephedrine production was achieved on 12th day under the influence of 7.5 mM L-phenylalanine (112.77± 0.54 μg g -1 dry weight and 588.68 ± 1.84 μg g -1 dry weight, respectively). Practically the obtained results can be a useful recommendation for the usage of this biotechnological method in bioreactors for ephedrine and pseudoephedrine production.

    Item Type: Thesis (PhD)
    Additional Information: Էֆեդրայի տեսակների, դրանց երկրորդային մետաբոլիտների ուսումնասիրությունը in vitro մշակույթում և կենսատեխնոլոգիայի մշակումը: Investigation of Ephedra Spp in vitro, its secondary metabolites and development of Biotechnology.
    Uncontrolled Keywords: Փարսաեիմեհր Ալի Հասսանի. Parsaeimehr Ali
    Subjects: Biology
    Divisions: UNSPECIFIED
    Depositing User: NLA Circ. Dpt.
    Date Deposited: 26 Sep 2016 13:39
    Last Modified: 26 Sep 2016 13:39
    URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/3488

    Actions (login required)

    View Item