Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Ալիֆատիկ դիկարբոնաթթուների խոլինային էսթերների խոլինէսթերազային հիդրոլիզի կինետիկան և մեխանիզմը

Մնացակայան, Մարինե Ռամանի (2011) Ալիֆատիկ դիկարբոնաթթուների խոլինային էսթերների խոլինէսթերազային հիդրոլիզի կինետիկան և մեխանիզմը. PhD thesis, ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ ՊՈԱԿ.

[img]
Preview
PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (483Kb) | Preview

    Abstract

    Одной из важнейших проблем современной биотехнологии является изучение и установление механизмов взаимодействия небольших молекул лигандов с биомакромолекулами, в частности, с ферментами. Выявление закономерностей указанных взаимодействий и их обобщение в значительной степени облегчит задачу поиска новых биологически активных веществ с заданными свойствами. Рассматриваемая задача изучалась и до появления сравнительно новой области науки биотехнологии и в этом направлении учеными накоплен большой материал. Тем не менее исследования в этом направлении интенсивно продолжаются и непрерывно дополняются данными, раскрывающими новые аспекты механизма обсуждаемых взаимодействий. Ацетилхолинэстераза (АХЭ ЕС 3.1.1.7) и бутирилхолинэстераза (БХЭ ЕС 3.1.1.8) являются важнейшими компонентами холинэргической системы организма (Karczmar A.G., 2010). Со времен открытия холинэстераз прошло уже почти сто лет и за этот период времени учеными показано, что специфическое воздействие на АХЭ и БХЭ in vivo может привести к диаметрально противоположным результатам. Так, приблизительно полвека назад было показано, что основными мишенями фосфорорганических ядов (боевые отравляющие вещества – зарин, зоман, табун и др., пестициды – ацефат, хлорпирифос, малатион и др.) являются ферменты АХЭ и БХЭ. Рядом авторов было показано, что механизм их действия основан на необратимом ингибировании (фосфорилировании) холинэстераз (ХЭ) в холинэргических синапсах (Mason H.J., 1993). Выявленный механизм был использован для создания и усовершенствования боевых отравляющих веществ массового поражения. В мирных целях тот же подход используется для создания фосфорорганических пестицидов (Raveh L., Grauver E., Grunwald J. et al. 1997). Изучение механизмов взаимодействия обратимых ингибиторов с ХЭ позволило разработать специфические препараты, способные защищать организм от воздействия фосфорорганических ядов. А после того, как было выяснено, что патология болезни Альцгеймера (БА) тесно связана с соотношением активностей холин ацетилтрансферазы, (АХЭ) и (БХЭ) в пресинаптических ганглиях мозга, была разработана методология симптоматического лечения этой болезни, основанная на применении специфических обратимых ингибиторов АХЭ и БХЭ (антихолинэстеразных препаратов такрин, ривастигмин, галантамин, донепезил и др.). Установление механизма реакции дефосфорилирования (реактивации) инактивированной ХЭ позволило создать антидоты фосфорорганических ядов. Отметим, что в настоящее время для лечения ряда заболеваний в медицине широко применяются также и другие препараты, которые являются субстратами, ингибиторами, активаторами или реактиваторами ХЭ (Brown J.H., Wetzel G.T., Dunlap J., 1982). Учитывая огромное пркладное значение ХЭ и их специфических лигандов большое внимание уделяется исследованию закономерностей холинэстеразного катализа. Однако, несмотря на значительные успехи в этой области, по настоящее время не сформулированы модели, позволяющие в полном объеме объяснить особенности холинэстеразного катализа. В частности к этим особенностям относятся отклонения от кинетики Михаэлиса при гидролизе ряда субстратов (активация или торможение), нарушение конкурентности в смесях субстратов, субстратов и обратимых ингибиторов и др. Ատենախոսական աշխատանքը նվիրված է մարդու և ձիու μութիրիլխոլինէսթերազ (ԲուԽԷ) ֆերմենտների ազդեցությամμ ալիֆատիկ դիկարμոնաթթուների դիխոլինային էսթերների (ԴԽԷ) ֆերմենտային հիդրոլիզի առանձնահատկությունների ուսումնասիրությանը: Աշխատանքը իրականացվել է “Կենսատեխնոլոգիայի ԳՀԻ” ինժեներային էնզիմոլոգիայի լաμորատորիայիում: Առաջին անգամ ցույց է տրված, որ ԴԽԷ-ների շարքի երկար մեթիլենային շղթա ունեցող ներկայացուցիչների (սկսած խցանաթթվի դիխոլինային էսթերից) խոլինէսթերազային հիդրոլիզը չի ընթանում գրականության մեջ նկարագրված երկփուլ մեխանիզմով, այն դեպքում երμ ավելի կարճ մեթիլենային շղթայով ԴԽԷ-ների մոտ այդ մեխանիզմը պահպանվում է: Ցույց է տրված, որ ի տարμերություն շարքի ցածր ներկայացուցիչների ֆերմենտային հիդրոլիզի խիստ տարանջատված երկփուլ մեխանիզմի, երμ առաջին փուլի արգասիք հանդիսացող դիկարμոնաթթվի մոնոխոլինային էսթերը (ՄԽԷ), սկսում է հիդրոլիզվել ռեակցիոն միջավայրից միայն ԴԽԷ-ի սպառումից հետո, դիկարμոնաթթուների դիխոլինային էսթերների շարքի μարձր ներկայացուցիչների ֆերմենտային հիդրոլիզի դեպքում մոնոխոլինային էսթերը սկսվում է հիդրոլիզվել ռեակցիայի առաջին փուլում, երμ ռեակցիոն միջավայրում դեռ առկա է դիխոլինային էսթերը: Երկփուլ մեխանիզմի խախտման մասին է վկայում հիդրոլիզի առաջին փուլում առաջացած թթվային արգասիքի ակնհայտ ավելցուկը (15 - 75 % կախված ԴԽԷ-ի մեթիլենային շղթայի երկարությունից), որը կարող է վերագրվել միայն համապատասխան դիկարμոնաթթվի առաջացմանը: Իրականացված քրոմատո-գրաֆիական անալիզի տվյալները հաստատում են, որ առաջին փուլում անջատված թթվային արգասիքի ավելցուկը համապատասխան դիկարμոնաթթուն է: Հայտնաμերված «անոմալ» հիդրոլիզի մեխանիզմի պարզաμանման նպատակով իրականացվել են տվյալ սուμստրատների խոլինէսթերազային հիդրոլիզի ավելի խորը կինետիկական հետազոտություններ և փորձնական ճանապարհով որոշվել են մարդու և ձիու ԲուԽԷ-ների ազդեցությամμ μարձր՝ խցանաթթվի և սեμացինաթթվի դիխոլինային էսթերների և միևնույն դիկարμոնաթթուների մոնոխոլինային էսթերների հիդրոլիզի կինետիկական առանձնահատկությունները, հաշվարկվել են կինետիկական պարամետրերի արժեքները: Ցույց է տրվել, որ երկար մեթիլենային շղթա ունեցող ԴԽԷ-ների խոլինէսթերազային հիդրոլիզի «անոմալ» ընթացքի առկայությունը կախված չէ ֆերմենտի ծագումից: Չնայած, ձիու ԲուԽԷ-ի դեպքում ԴԽԷ-ի ՄԽԷ-ի Km –ի արժեքների տարμերվում են ավելի քան 1000 անգամ, հիդրոլիզի առաջին փուլում առաջացած թթվային արգասիքի ավելցուկը հասնում է 75 %-ի: Փորձնական ճանապարհով որոշվել են ուսումնասիրվող միացությունների խոլինէսթերազային հիդրոլիզի կինետիկական պարամետրերը (Km և Vmax) շարքի թե երկար, և թե կարճ մեթիլենային շղթա ունեցող անդամների համար: Ստացված արժեքները համեմատվել են գրականության մեջ առկա տվյալների հետ: The thesis devoted to the study of features of cholinesterase-catalyzed hydrolysis of aliphatic dicarboxylic acid dicholine esters (DChE) by human and horse butyrylcholinesterase (BChE). The work was carried out in the laboratory of engineering enzymology of SRI “Biotechnology”. It was shown for the first time, that the hydrolysis of DChE homologous series with long methylene chain (starting with suberic acid dicholine ester) by butyrylcholinesterase doesn’t run by two-stage mechanism, described in literature, while in case of DChEs with shorter methylene chain, the two-stage mechanism is persisted. It was shown, that unlike the strictly separated two-stage mechanism of enzymatic hydrolysis of this series shorter members, when first stage product dicarboxylic acid monocholine ester (MChE) starts to get hydrolysed after DChE was exhausted from the reaction medium, in case of higher members of DChE series enzymatic hydrolysis, MChE starts to get hydrolysed in the first stage of reaction, when there is DChE in the reaction medium. The significant excess of acid product formed during the first stage of the hydrolysis (15 – 75 % depending on length of methylene chain) is the evidence of violation from the two-stage mechanism. This excess could be attributed only to the formation of dicarboxylic acid during the first stage of hydrolysis. The data of the conducted chromatographic analysis indicates that the excess of formed acid product conforms to corresponding dicarboxylic acid. To clarify the mechanism of found “anomalous” hydrolysis detailed kinetic studies of cholinesterase-catalyzed hydrolysis of given substrates have been conducted. The kinetic features of suberic and sebacic acids dicholine esters and monocholine esters (MChE) hydrolysis by human and horse butyrylcholinesterase have been determined experimentally and values of kinetic constants have been calculated. It was shown that the “anomaly” of cholinesterase-catalyzed hydrolysis of DChEs with long methylene chain, does not depend on the source of enzyme. Although in case of horse BChE the ratio of Km values for MChE and DChE is more than 1000, the excess of acid product during the first stage of hydrolysis is 75 %. The kinetic parameters (Km and Vmax) of cholinesterase-catalyzed hydrolysis have been determined experimentally for compounds both with long methylene chain and short methylene chain. The obtained results have been compared with literature data. The influence of reaction medium conditions (temperature and pH) on higher DChEs hydrolysis mechanism and kinetic parameters has been studied. The activation energies of studied reactions have been calculated. It was shown that temperature changes between 11 ÷ 35˚ C and pH changes between 6.5 ÷ 7.6 do not affect the “anomalous” hydrolysis mechanism. Experimentally obtained kinetic parameters (Km and Vmax) of DChEs and MChEs hydrolysis have been used for construction of theoretical calculated curves.

    Item Type: Thesis (PhD)
    Additional Information: Ալիֆատիկ դիկարբոնաթթուների խոլինային էսթերների խոլինէսթերազային հիդրոլիզի կինետիկան և մեխանիզմը: The kinetics and mechanism of cholinesterase-catalyzed hydrolysisof aliphatic dicarboxylic acid dicholine esters.
    Uncontrolled Keywords: Մնացակայան Մարինե Ռամանի, Mnatsakanyan Marine R.
    Subjects: Biology
    Divisions: UNSPECIFIED
    Depositing User: NLA Circ. Dpt.
    Date Deposited: 26 Sep 2016 14:27
    Last Modified: 26 Sep 2016 14:27
    URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/3490

    Actions (login required)

    View Item