Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Կենսատրանսֆորմացիայի եղանակով L-թիրոզինի և D-ասպարագինաթթվի ստացման կատարելագործված մեթոդների մշակում

Դյուկովա, Կարինե Գեորգիի (2011) Կենսատրանսֆորմացիայի եղանակով L-թիրոզինի և D-ասպարագինաթթվի ստացման կատարելագործված մեթոդների մշակում. PhD thesis, «Հայկենսատեխնոլոգիա» գիտաարտադրական կենտրոն ՊՈԱԿ.

[img] PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (814Kb)

    Abstract

    В связи с неуклонно растущей потребностью в белковых и не-белковых аминокислотах, происходит углубленное изучение существующих методов их получения и поиски новых способов, пригодных для практического использования. (The 12th Inter-national Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins. August 1-5, 2011, Beijing, China). Существующие на сегодняшний день технологические способы производства аминокислот в основном базируются на методах микробиологического синтеза и биотрансформации. Эти методы не только взаимно дополняют друг друга, но и, в определенном смысле, являются конкурирующими. В настоящее время большинство природных аминокислот производятся методом микробио-логического синтеза. Однако, данный метод, несмотря на очевидные преимущества (унифицированность и доступность сырья, наличие типового оборудования и др.), обладает рядом недостатков, среди которых два наиболее существенных - это большие капитальные затраты при организации производства и необходимость в больших, имеющих стратегическое значение, ферментаторах. Осуществить такое производство под силу государствам, обладающим мощным экономическим потенциалом. В отличие от микробиологического синтеза, биотрансформационный метод получения аминокислот является несравнимо доступнее в реализации. Это, в частности, связано с использованием сравнительно небольшого количества биомассы, необходимого для приготовления биокатализатора, простотой, компактностью производственных технологических линий, отсутствием необходимости в больших капитальных вложениях для организации производства, экономичностью и рентабельностью даже малотоннажного производства. Известные на сегодняшний день технологии получения некоторых аминокислот, основанные на биотрансформации, где в качестве исходного сырья используется фумаровая кислота, стали стартовыми для реализации технологий получения целого ряда новых соединений. Круг соединений, получаемых из фумаровой кислоты, значительно увеличился за последнее время, что в перспективе открывает еще более широкие возможности. Исходя из фумаровой кислоты можно получить L-яблочную, L- и D-аспарагиновые кислоты, L-α-аланин и β-аланин, L-фенилаланин L-тирозин, L-триптофан и L-ДОФА, аспаркам (панангин), аспартам (подсластитель) и др. В настоящее время как в нашей республике, так и во всем регионе (РФ, Грузия, Азербайджан, Турция, Иран и т.д.) аминокислоты не производится. Вследствие указанных выше причин, безусловно, данная работа, посвященная биотрансформационному получению D-аспарагиновой кислоты и L-тирозина, является весьма важной и актуальной. Цель исследований. Целью данной работы является усовершенствование биотрансформационных процессов получения L-тирозина и D-аспарагиновой кислоты, которые согласно разработанному нами подходу, входят в перечень продуктов, для которых фумаровую кислоту можно рассмотреть в качестве первичного исходного сырья. Для достижения поставленной цели проведенны следующие основные исследования: Проведен критическиий обзор биотрансформационных методов получения L-тирозина и D-аспарагиновой кислоты и выявлены их основные недостатки. Для радикального повышения эффективности биотрансформационного процесса синтеза L-тирозина из фенола, пирувата и ацетата аммония, разработан и исследован новый биокатализатор, иммобилизованной на твердой подложке тирозин-феноллиазы (ТФЛ) из клеток C. freundii (DMMSU-115) Проведены исследования для разработки оптимальных условий: а) культивирования бактериальных клеток C. freundii и биосинтеза ТФЛ, б) выделения и очистки ТФЛ из C. freundii. Для упрощения и улучшения экологических характеристик одновременного производства D-аспарагиновой кислоты и L-аланина исследован процесс декарбоксилирования D,L-аспарагиновой кислоты под действием L-аспартат-β-декарбоксилазы Ps. docunhae (АТСС-21192), в условиях, при которых для поддержания оптимального значения pH реакционной среды, в качестве титранта, используется кристаллическая (свободная) D,L- аспарагиновая кислота. Определены кинетические характеристики процессов получения L-тирозина и D-аспарагиновой кислоты. Որոշ ամինաթթուների ստացման համար ֆումարաթթուն որպես առաջնային հումք օգտագործող կենսափոխակերպման վրա հիմնված հայտնի տեխնոլոգիաները հենակետ են հանդիսանում մի շարք նոր նյութերի արտադրման տեխնոլոգիաների մշակման համար: Վերջին տարիներին ֆումարաթթվից ստացվող նյութերի շրջանակը զգալիորեն լայնացել է: Ֆումարաթթվի հիման վրա կարող են արտադրվել մի շարք կարևոր նշանակություն ունեցող նյութեր` L-խնձորաթթու, L- և D-ասպարագինաթթու, L-α-ալանին և β-ալանին, L-ֆենիլալանին, L-թիրոզին և L-ԴՕՖԱ, ասպարկամ (Պանանգին) և ասպարտամ (քաղցրացուցիչ) և այլն: Ատենախոսական աշխատանքում կատարված է վերը նշված նյութերից L-թիրոզինի և D-ասպարագինաթթվի ստացման կենսափոխակերպման պրոցեսների վերլուծություն: Արդյունքում բացահայտված են դրանց ստացման տեխնոլոգիաների հիմնական թերությունները և առաջարկված են այդ ամինաթթուների ստացման առավել արդյունավետ տեխնոլոգիաներ: Ֆենոլից, պիրոխաղողաթթվից և ամոնիումի ացետատից L-թիրոզինի սինթեզի կենսա-փոխակերպման պրոցեսի արդյունավետության բարձրացման համար հիմնավորված և կիրառված է պինդ կրիչի մակերևույթի վրա կովալենտ իմոբիլիզացված տիրոզին ֆենոլ-լիազի (ԹՖԼ) /C. freundii-ի (DM MSU-115)/ նոր կատալիզատոր: Նշված կատալիզատորի ստացման համար մշակված է էժան և մատչելի բաղադրիչներից C. freundii-ի աճեցման ֆերմենտացիոն միջավայր: Ընդ որում, առաջարկվող աճի միջավայրը, որն իրենից ներկայացնում է L-ասպարագինաթթվի հավելումով սինթետիկ միջավայր, բերում է բարձր ԹՖԼ ակտիվությամբ կուլտուրայի արագ աճի, որն իր տեսակարար ակտիվությամբ մեկ կարգով գերազանցում է գրականության մեջ հայտնի տվյալները: ԹՖԼ-ի մաքրման նկարագրված եղանակի կիրառման արդյունքում հնարավոր է դարձել ֆերմենտային պրեպարատի տեսակարար ակտիվությունը բարձրացնել մոտ 6 անգամ, իսկ ելքը հասցնել 40%-ի: Անօրգանական կրիճի վրա ԹՖԼ կովալենտ իմոբիլիզացումը հանգեցրել է կենսակատալիզատորի կիսաինակտիվացման պարբերությունը հասցնել մոտ 25 օրվա, ինչը զգալիորեն մոտ 20 անգամ գերազանցում է տարբեր գելերում իմոբիլիզացված բջիջների, ինտակտ բջիջների ինչպես նաև մաքրած ֆերմենտների համար հայտնի համանման պարամետրերը: Իմոբիլիզացված կենսակատալիզատորի ինտեգրալ արդյունավետությունը (38 օրում սինթեզված պրոդուկտի ընդհանուր քանակը) 1 գ սպիտակուցի հաշվով կազմել է մոտ 200 գ L-թիրոզին, ինչը 5 անգամ գերազանցում է ինտակտ բջիջների արդյունավետությանը: Մշակված կեսակատալիզատորը հարմար է բազմակի օգտագործման համար, քանի որ այն դյուրին է առանձնացնել պրոդուկտի բյուրեղներից: D,L-ասպարագինաթթվից D-ասպարագինաթթվի ստացման համար որպես ելանյութ է օգտագործված L-ասպարագինաթթուն: Այդ նպատակով Ֆումարաթթվից ստացված L-ասպարագինաթթուն ենթարկվել է ռացեմիզացման: Ցույց է տրվել, որ L-ասպարագինաթթվի ռացեմիզացման համար բարձր արդյունավետությաբ կարելի է կիրառել միկրոալիքային ճառագայթման եղանակը: Ուսումնասիրվել է L-ասպարտատ-β-դեկարբօքսիլազային ակտիվությամբ Ps. docunhae-ի բջիջների կիրառմամբ կենսակերպա-փոխմամբ D,L-ասպարագինաթթվից D-ասպարագինաթթվի և L-ալանինի միաժամանակյա ստացման պրոցեսը: Կինետիկական տվյալների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ D-ասպարագինաթթվի և L-ալանինի բարձր կոնցենտրացիաները գործնականում չեն նվազեցնում դեկարբօքսիլացման արագությունը: Կիրառված տեխնոլոգիական նոր մոտեցումների համաձայն ռեակցիոն միջավայրի տիտրումը կատարվում է բյուրեղական DL-ասպարագինաթթվով, ինչը թույլ է տալիս կենսափոխակերպման պրոցեսը տանել մինչև սուբստրատի 95% կոնվերսիան պրակտիկորեն հաստատուն pH-ի պայմաններում և հետևաբար նաև հաստատուն արագությամբ: The well-known biotransformation-based technologies for obtaining some amino acids with fumaric acid used as raw material became launch pad for realization of technologies for production of a series of new compounds. The range of compounds produced from fumaric acid has significantly enlarged for the past few years that open vast possibilities in future. On the base of fumaric acid the following compounds can be produced: L-malic acid, L- and D-aspartic acids, L-α-alanine and β-alanine, L-phenylalanine, L-tyrosine and L-DOPA, asparcam and aspartame, etc. This thesis is devoted to investigation of biotransformation processes for production of L-tyrosine and D-aspartic acid that, pursuant to the developed by us approach, constitute a list of products for which fumaric acid may be considered as raw material. Thorough review of biotransformation methods for production of L-tyrosine and D-aspartic acid was performed and their main shortcomings were revealed. To increase efficiency of biotransformation process for L-tyrosine synthesis from phenol, pyruvic acid and ammonium acetate, a new immobilized on solid substrate catalyst – tyrosine phenol-lyase (TPL) from C. freundii (DM MSU-115) has been developed and investigated. The following investigations have been carried out for elaboration of optimal conditions: a) cultivation of C. freundii bacterial cells and biosynthesis of TFL; b) isolation and purification of TPL from C. freundii. To simplify and improve ecological characteristics of the technology of simultaneous production of D-aspartic acid and L-alanine, the process of decarboxylation of D,L-aspartic acid by L-aspartat β-decarboxylase from Ps. docunhae (АТСС-21192) has been studied. In this study the fermentation medium for growing C. freundii, consisting of cheap and available components, was developed. Suggested synthetic growth medium with addition of L-aspartic acid provides the rapid culture growth with high tyrosine phenol-lyase activity, which by order exceeds the analogous index for TPL known from literature. An efficient method for TPL purification from C. freundii has been offered, which allows obtaining the purified enzyme in high yield using minimum purification steps. As a result of described purification procedure, the specific activity of preparation arises by 6,1 times, and the yield of activity makes up 40.2 %. The obtained purified enzyme preparation exhibits maximum activity at 35 0C and pH 8.5. It was shown, that in case of keeping in glycerol in presence of mercaptoethanol the enzyme half lifetime increased by many times making up 25 days. Immobilization of a purified preparation of TPL from C. freundii on silica gel- or silochrom-based inorganic carriers by the method of covalent binding has been carried out, and the properties of the immobilized preparation were investigated. To bind the purified enzyme to the carrier, modified by γ-aminopropyltriethoxysilane, glutaraldehyde was used as a cross-linking reagent. As a result of the above-mentioned immobilization, the half-life of TPL was prolonged up to 25 days that considerably exceeds (by 5-20 times) the similar parameters for the cells immobilized into various gels, intact cells and also for the purified enzyme. The integral productivity of immobilized biocatalyst (the total amount of product synthesized within 38 days) was ~200 g of tyrosine per 1 g protein that is 5 fold higher than the productivity of the intact cells. The biocatalyst was convenient in operation due to the opportunity of its easy separation from the product crystals.

    Item Type: Thesis (PhD)
    Additional Information: Կենսատրանսֆորմացիայի եղանակով L-թիրոզինի և D-ասպարագինաթթվի ստացման կատարելագործված մեթոդների մշակում: Development of improved methods of L-tyrosine and D-aspartic acid production by biotransformation.
    Uncontrolled Keywords: Դյուկովա Կարինե Գեորգիի, Dyukova Karine
    Subjects: Biology
    Divisions: UNSPECIFIED
    Depositing User: NLA Circ. Dpt.
    Date Deposited: 27 Sep 2016 10:45
    Last Modified: 27 Sep 2016 10:45
    URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/3491

    Actions (login required)

    View Item