Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Alcaligenaceae ընտանիքի նոր տեսակի մանրէներից D-ամինաացիլազի անջատումը, բնութագրումը և կիրառման հնարավորությունները

Մխիթարյան, Աննա Վարդգեսի (2015) Alcaligenaceae ընտանիքի նոր տեսակի մանրէներից D-ամինաացիլազի անջատումը, բնութագրումը և կիրառման հնարավորությունները. PhD thesis, ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ ՊՈԱԿ.

[img]
Preview
PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (655Kb) | Preview

    Abstract

    Համաշխարհային շուկայում սպիտակուցային և ոչ սպիտակուցային ամինաթթուների պահանջարկի մեծացմանը զուգընթաց մեծանում է նաև դրանց նկատմամբ հետաքրքրությունը և փնտրվում են վերջիններիս ստացման նորագույն եղանակներ, որոնք առավել նպատակահարմար և գործնականում կիրառելի կլինեն: Սովորաբար ամինաթթուները ստացվում են մանրէաբանական, քիմիական, ինչպես նաև կենսատրանսֆորմացիոն եղանակներով, որոնք փոխադարձաբար լրացնելով միմյանց, հանդիսանում են նաև խիստ մրցակցային: Ներկայումս ամինաթթուների արտադրության մեջ գործնականում ավելի կիրառելի են մանրէաբանական և կենսատրանսֆորմացիոն եղանակները: Այժմ բնական ամինաթթուները մեծամասամբ ստացվում են մանրէաբանական սինթեզով: Ի տարբերություն մանրէաբանական սինթեզի, կենսատրանսֆորմացիոն եղանակով ամինաթթուների ստացման պրոցեսը անհամեմատ ավելի պարզ է և մատչելի: Դա մասնավորապես պայմանավորված է կենսակատալիզատորի ստացման համար համեմատաբար փոքր քանակությամբ կենսազանգվածի օգտագործմամբ, գործընթացի պարզությամբ, արտադրության իրականացման ժամանակ խոշոր կապիտալ ներդրումների անհրաժեշտության բացակայությամբ, շահութաբերությամբ և փոքրածավալ արտադրության դեպքում գործընթացի արդյունավետությամբ: Կենսատրանսֆորմացիոն եղանակի իրականացման ժամանակ հիմնական դերը պատկանում է ֆերմենտներին: Չնայած բարձր ելքերով նպատակային ֆերմենտային պատրաստուկների ստացման տեխնոլոգիաների կատարելագործմանը, դրանց գինը շարունակում է մնալ բարձր: Օպտիկապես մաքուր ամինաթթուների ստացման համար առավել պահանջված ֆերմենտներ են հանդիսանում ամինաացիլազները: Կենսակատալիտիկ եղանակով այս ֆերմենտներով կարելի է ստանալ օպտիկապես ակտիվ D- և L-ամինաթթուներ: Քիմիական եղանակով ստացված N-ացետիլ-DL-ամինաթթուներից կենսատրանսֆորմացիոն եղանակով D-ամինաթթուների ստացման պրոցեսի նկատմամբ հետաքրքրությունը գնալով մեծանում է: Առավել նպատակահարմար է իմոբիլի-զացված կենսակատալիզատորների կիրառումը: Հողի տարբեր նմուշներից D-ամինաացիլազային ակտիվությամբ նոր շտամների անջատումը, համապատասխան ֆերմենտի մաքրման արդյունավետ եղանակների մշակումը, ֆիզիկա-քիմիական և կատալիտիկ հատկությունների ուսումնասիրությունը, իմոբիլիզացումը և ի վերջո կենսատրանսֆորմացիայով D-ամինաթթուների ստացումը ակնհայտորեն արդիական է և կարևոր: Աշխատանքի նպատակն է՝ Հողի նմուշներից անջատել D-ամինաացիլազային ակտիվությամբ նոր բակտերիալ շտամներ, բնութագրել առավել հեռանկարային շտամի D-ամինաացիլազը և հետազոտել համապատասխան ֆերմենտի իմոբիլիզացման հնարավորություններն ու ստացվող կենսակատալիզատորի կիրառման հեռանկարները կենսատեխնոլոգիայում: Այդ նպատակին հասնելու համար դրվել են հետևյալ խնդիրները` Հողի նմուշներից անջատել D-ամինաացիլազային ակտիվությամբ բակտերիալ շտամներ և կատարել դրանց նախնական բնութագրում; Ստացված առավել տեխնոլոգիական շտամից անջատել, մաքրել D-ամինաացիլազը և հետազոտել դրա ֆիզիկա-քիմիական և կատալիտիկ բնութագրերը; Հետազոտել ստացված D-ամինաացիլազի իմոբիլիզացման հնարավորություն-ները և ստացվող կենսակատալիզատորի որոշ տեխնոլոգիական բնութագրերը: Параллельно с повышением спроса на белковые и небелковые аминокислоты на мировом рынке, также увеличивается интерес к этим веществам и разыскиваются инновационные способы получения последних, которые были бы наиболее приемлемыми и практичными в исполнении. Выделение новых штаммов с D-аминоацилазой активностью из различных образцов почвы, разработка эффективных методов очистки соответствующего фермента, изучение его физико-химических и каталитических свойств, иммобилизация, и в конечном итоге, получение D-аминокислот биотрансформационным способом, несомненно актуально и важно. Данная диссертационная работа посвящена выделению бактериальных штаммов с D-аминоацилазной активностью из образцов почвы и их предварительной характеристике, очистке D-аминоацилазы из штамма с наилучшими характеристиками и изучению его физико-химических и каталитических свойств, иммобилизации полученного фермента и изучению некоторых технологических характеристик иммобилизованного фермента. Из разных образцов почвы были выделены новые бактерии, владеющие D-аминоацилазной активностью, из числа которых для дальнейшего изучения был отобран штамм AM6.1. БЛАСТ анализ 1002 п.о. нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штамма AM6.1 с базой данных аналогичных последовательностей эубактерий и архебактерий выявил максимум 83% гомологии с представителями семейства Alcaligenaceae – Achromobacter и Bordetella. На основании полученных результатов мы относим штам AM6.1 к новому виду и даже к новому роду семейства Alcaligenaceae. На основе ионообменной хроматографии и хроматографии на гидроксиапатите нами была разработана схема выделения и очистки D-аминоацилазы штамма AM6.1 в результате которой удельная активность ферментного препарата увеличивается в 870 раз с общим выходом активности – 3 %. Методом гель-фильтрации было показано, что молекулярный вес D-аминоацилазы штамма AM6.1 составляет 66 кДа. Были изучены температурный и pH оптимумы, термостабильность и зависимость термостабильноти от pH для изучаемого фермента. Изучали действие некоторых термопротекторных соеденений, ионов двухвалентных металлов, реагентов SH-групп на активность фермента. Было показано, что D-аминокислоты, в частности D-валин, являются хорошим термостабилизатороми для D-аминоацилазы штамма AM6.1. Также, было показано, что SH-группы не имеют особой значимости для действия фермента, а ионы Zn2+ по видемому являются коферментом. Исследования субстратной специфичности показали, что D-аминоацилаза штамма AM6.1 проявляет абсолютную стереоспецифичность к D-стереоизомерам N-ацетил-амиинокислот. N-ацетил-D-метионин, а также ароматические и гидрофобные N-ацетил аминокислоты являются хорошими, а основные N-ацетил-аминокислоты - плохими субстратами для фермента. Кислые и гидрофильные N-ацетил-D-аминокислоты не являются субстратами для фермента. С применением линейного регрессионного анализа рассчитаны константы Михаелиса (Кm) и максимальные скорости реакции (Vmax) для следующих субстратов: N-ацетил-D-метионин, N-ацетил-D-аланин, N-ацетил-D-фенилаланин, N-ацетил-D-тирозин, N-ацетил-D-валин, N-ацетил-D-оксивалин, N-ацетил-D-лейцин. Показано субстратное ингибирование D-аминоацилазы N-ацетил-D-лейцином (Ks=35,5 ± 28,3 мМ) и N-ацетил-D-тирозином (Ks=15,8 ± 4,5 мМ). Наблюдалось конкурентное ингибирование изучаемого фермента продуктом – уксусной кислотой (Ki =104,7 ± 21,7 мМ, Km=2,5 ± 0,5 мМ, Vmax=25,1 ± 1,5 Ед/мг). Нами проведена ковалентная иммобилизация D-аминоацилазы штамма AM6.1 на силохроме C-80 посредством аминогрупп. В результате оптимизации условий реакции нам удалось сохранить 20 % ферментативной активности преперата после иммобилизации. Температурный и pH опимумы, термостабильность и зависимость термостабильноти от pH для иммобилизированного фермента сравнивались с аналогичными показателями свободного фермента. Было показано, что после иммобилизации оптимальная температура остается неизменным – 40 oC, оптимальный pH сдвигается из области 7,5-7,8 в область 7,1-7,5, термостабильность повышается на 5 oC, а область максималной термостабильности расширяется от pH 8,8-9,3 до рН 5,0-11,0. In parallel with the increase in demand for protein and non-protein amino acids in the global market is also increasing interest in these substances and sought innovative ways to get the latest, which would be the most appropriate and practical to implement. Isolation of new strains with the D-aminoacylase activity of various soil samples, the development of effective methods of purification of the corresponding enzyme, the study of its physico-chemical and catalytic properties, immobilization, and ultimately, obtaining D-amino acids by biotransformation process, is certainly relevant and important. This thesis deals with the isolation of bacterial strains with D-aminoacylase activity from soil samples and their preliminary characterization, purification of D-aminoacylase from the strain with the best characteristics and the study of physico-chemical and catalytic properties of the enzyme, immobilization of obtained enzyme and the study of some technological characteristics of the immobilized enzyme. From different soil samples were allocated new bacteria possessing D-aminoacylase activity, of which for the further study strain AM6.1 was selected. BLAST analysis of the 1002 bp nucleotide sequences of the 16S rRNA gene of strain AM6.1 with a database of similar sequences of eubacteria and archaea revealed a maximum 83 % homology with the representatives of the family Alcaligenaceae - Achromobacter and Bordetella. Based on these results we refer the new strain AM6.1 to the new species, and even to the new genus of the family Alcaligenaceae. Based on ion exchange chromatography and hydroxylapatite chromatography, we developed a scheme for isolation and purification of D-aminoacylase of strain AM6.1, in which resulte the specific activity of the enzyme preparation increased to 870 times with a total activity yield - 3%. By gel filtration was found that the molecular weight of D-aminoacylase of AM6.1 strain is 66 kDa. We studied the temperature and pH optima, thermal stability and dependence of termostability on pH for studied enzyme. The effect of some thermoprotective compounds, divalent metal ions, reagents of SH-groups in the activity of the enzyme was studied. It has been shown that D-amino acids, in particular D-valine, are good for thermostabilization of D-aminoacylase of AM6.1 strain. Also, it has been shown that SH-groups have no particular significance for the enzyme activity, and Zn2 + ions seems to be coenzyme. Studies of substrate specificity revealed that the D-aminoacylase of AM6.1 strain exhibits absolute stereospecificity to the D-stereoisomers of N-acetyl-amino acids. N-acetyl-D-methionine, as well as aromatic and hydrophobic N-acetyl-amino acids are good substrates and the basic N-acetyl-amino acids are poor substrates for studied enzyme. The acidic and hydrophilic N-acetyl-D-amino acids can not serve as substrates for studied D-aminoacylase. Using linear regression analysis Michaelis constant (Km) and maximum reaction velocity (Vmax) were calculated for the following substrates: N-acetyl-D-methionine, N-acetyl-D-alanine, N-acetyl-D-phenylalanine, N-acetyl-D-tyrosine, N-acetyl-D-valine, N-acetyl-D-oxyvaline, N-acetyl-D-leucine. Substrate inhibition of D-aminoacylase was displayed with N-acetyl-D-leucine (Ks = 35.5 ± 28.3 mM) and N-acetyl-D-tyrosine (Ks = 15.8 ± 4.5 mM). Competitive inhibition of the studied enzyme with product – acetic acid was observed (Ki = 104.7 ± 21.7 mM, Km = 2.5 ± 0.5 mM, Vmax = 25.1 ± 1.5 U/mg).

    Item Type: Thesis (PhD)
    Additional Information: Выделение, характеристика и возможности применения D-аминоацилазы выделенной из новых микробов семейства Alcaligenaceae. Isolation, characterization and possibilities of application of D-aminoacylase isolated from new microbs of Alcaligenaceae family.
    Uncontrolled Keywords: Мхитарян Анна Вардгесовна, Mkhitaryan Anna V.
    Subjects: Biology
    Divisions: UNSPECIFIED
    Depositing User: NLA Circ. Dpt.
    Date Deposited: 27 Sep 2016 10:59
    Last Modified: 03 Oct 2016 10:31
    URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/3492

    Actions (login required)

    View Item