Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

L-ալանինի բարձրակտիվ շտամ-արտադրիչների ստացումը և կենսասինթեզի տեխնոլոգիայի մշակումը

Մելքոնյան, Լուսինե Հովհաննեսի (2013) L-ալանինի բարձրակտիվ շտամ-արտադրիչների ստացումը և կենսասինթեզի տեխնոլոգիայի մշակումը. PhD thesis, ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ ՊՈԱԿ.

[img]
Preview
PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (1691Kb) | Preview

    Abstract

    Ատենախոսության թեմայի արդիականությունը Ալանինը (a-ամինապրոպիոնաթթու, C3H7O2N) փոխարինելի ամինաթթու է, այն լայն տարածված է բնության մեջ և հանդիպում է գրեթե μոլոր օրգանիզմներում: Ալանինն ունի լայն կիրառություն բժշկությունում` ինֆուզիոն լուծույթների արտադրության համար, գյուղատնտեսության μնագավառում` հերբիցիդների, ֆունգիցիդների, ակարիցիդների կազմում, սննդի արդյունաμերությունում` որպես սննդի քաղցրացուցիչ և շաքարի ցածր կալորիականությամμ փոխարինիչ, օծանելիքի արտադրությունում: Ալանինը կիրառվում է նաև սինթետիկ թելերի արտադրությունում` որպես մետաքսի հիմնական μաղադրիչ և քիմիական արդյունաμերությունում՝ օրգանական միացությունների և պոլիմերների սինթեզում [Leuchtenberger W., 1996, Ivanov K. et al., 2013]: L-ալանինի համաշխարհային տարեկան արտադրությունը կազմում է 500 տոննա [Dworkin M., 2006, Demain A.L. et al., 2007]: L-ալանինի սինթեզի եղանակներից է դրա ստացումը DL-ալանինի ացետիլացման ճանապարհով: Ներկայումս, L-ալանինը արդյունաμերական մասշտաμներով ստացվում է հիմնականում կենսատրանսֆորմացիայի եղանակով` L-ասպարագինաթթվի էնզիմատիկ դեկարμօքսիլացման միջոցով: Սակայն նկարագրված եղանակներն առավելությունների հետ մեկտեղ ունեն մի շարք թերություններ, որոնք պայմանավորված են թանկարժեք հումքով, բազմափուլությամբ, աշխատատարությամբ: Սա է պատճառը, որ բազմաթիվ աշխատություններում նշվում է, որ էնզիմատիկ եղանակն ավելի նպատակահարմար է կիրառել ամինաթթվի փոքրածավալ արտադրությունում [Goto M. et al., 1992, Hols P. et al., 2003, Dworkin M., 2006, Սաղյան Ա.Ա., 2010]: L-ալանինի մեծածավալ արտադրության դեպքում ավելի արդյունավետ կարող է լինել մանրէաμանական եղանակը, քանի որ փոխարինելի ելանյութի շնորհիվ μավականին նվազում է L-ալանինի ինքնարժեքը, ինչը կարող է նպաստել այդ ամինաթթվի սպառման ծավալների մեծացմանը [Katsumata R. et al., 1996, Jarboe L.R. et al., 2010]: Ներկայումս, հայտնի են տարμեր ցեղերին (Arthrobacter, Corynebacterium, Escherichia) պատկանող L-ալանինի շտամ-արտադրիչներ, սակայն բազմաթիվ պատճառներով դրանք կիրառելի չեն արտադրական պայմաններում [Hashimoto S. et al., 1993, Dworkin M., 2006, Zhang X. et al., 2007, Jojima T. et al., 2010]: Ինչ վերաբերվում է տեխնոլոգիական հատկություններով արտադրության պայմաններին առավելապես համապատասխանող Brevibacterium ցեղին, ապա պետք է նշել, որ գրականությունում նկարագրված շտամները սինթեզում են միայն DL-ալանին [Katsumata R. et al., 1996, Nagwa M.A. et al., 2007], μացառությամμ Brevibacterium flavum АА5 (ВКПМ В-3991) շտամ-արտադրիչի, որը սինթեզում է 43,8 գ/լ L-ալանին: Այս շտամով L-ալանինի ստացման մանրէաμանական եղանակը մշակվել է 1988 թվականին Ամինաթթուների գիտահետազոտական տեխնոլոգիական ինստիտուտում (ներկայումս, ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ) և արտոնագրվել ԽՍՀՄ - ում, ԱՄՆ - ում [Азизян А.Г. и др., 1988, Azizian A.G. et al., 1992]: Ключевые слова: L-аланин, Brevibacterium flavum, мутация устойчивости, штамм-продуцент, аланинрацемаза, аланин-трансаминаза, валин:пируват-трансаминаза, лабораторный биореактор, ферментация Диссертационная работа посвящена получению высокоактивных штаммов-продуцентов L-аланина Br. flavum, изучению механизмов регуляции активности и синтеза ключевых ферментов биосинтеза L-аланина и получению L-аланина микробиологическим способом. В качестве исходного штамма в работе использован устойчивый к DL-α-АМК, ауксотрофный по D-аланину штамм-продуцент Br. flavum АА5, который в условиях ферментации в колбах синтезирует до 43,8 г/л L-аланина. С целью получения новых, более активных штаммов-продуцентов первоначально была изучена активность ключевых ферментов синтеза L-аланина. Показано, что по сравнению с активностью аланинрацемазы у штамма дикого типа Br. flavum ATCC 14067, активность этого фермента у штамма Br. flavum АА5 снижена почти на 99%. Было изучено также влияние структурных аналогов аминокислот – DL-α-АМК, L-циклосерина и β-Cl-Lаланина, а так же D-аланина, L-валина, которые связаны с биосинтезом L-аланина на активность аланин-трансаминазы и валин:пируват-трансаминазы. Исследования показали, что DL-α-АМК, L-циклосерин и β-Cl-L-аланин ингибируют активность аланин-трансаминазы и валин:пируват-трансаминазы. При этом β-Cl-L-аланин является наиболее сильным ингибитором аланин-трансаминазы, а L-циклосерин – валин:пируват-трансаминазы. Данные об ингибировании активности ферментов послужили основой для получения новых, высокоактивных штаммов, устойчивых к этим аналогам. В результате генетико-селекционных работ были отобраны штаммы, устойчивые к L-циклосерину и β-Cl-L-аланину. Наиболее активный штамм, устойчивый к 0,25 мг/мл L-циклосерина, на качалке в колбах синтезирует до 45 г/л L-аланина, а штаммы-продуценты Br. flavum GL1 и GL18, устойчивые к 0,025 мг/мл и 0,05 мг/мл β-Cl-L-аланина, в результате оптимизации технологических параметров процесса ферментации (по составу ферментационной и посевной среды, возрасту посевного материала и условий аэрации) в среде следующего состава: сахароза – 15%, (NH4)2SO4 – 5,5%, КН2РО4 – 0,1%, MgSO4 – 0,1%, СаСО3 – 5%, биотин – 500 мкг/л, тиамин – 70 мкг/л, D-аланин 100 мкг/мл в течение 96 часов синтезируют до 53,7 г/л и 60,5 г/л L-аланина, соответственно. Исследования показали, что полученные новые штаммы-продуценты Br. flavum GL1 и GL18 по культурально-морфологическим признакам не отличаются от исходного штамма Br. flavum АА5. Эти штаммы депонированы в Центре депонирования микробов при НПЦ «Армбиотехнология» НАН РА под номерами MDC 11841 (Br. flavum GL1) и MDC 11842 (Br. flavum GL18). Для выявления механизма сверхсинтеза L-аланина у штаммов-продуцентов Br. flavum GL1 и GL18 было изучено влияние β-Cl-L-аланина на активность аланин-трансаминазы. Выявлено, что у штамма Br. flavum GL1 50% – ное ингибирование активности этого фермента наблюдалось при 1.96 мМ β-Cl-L-аланина, а у штамма Br. flavum GL18 при концентрации более, чем 5.0 мМ β-Cl-L-аланина, в отличие от исходного штамма Br. flavum АА5, у которого 50% – ное ингибирование активности аланин-трансаминазы наблюдалось при 0.16 мМ β-Cl-L-аланина. Key words: L-alanine, Brevibacterium flavum, resistance mutation, strain-producer, alanine racemase, alanine transaminase, valine–pyruvate transaminase, laboratory bioreactor, fermentation. The aim of this thesis was to obtain highly active Br. flavum strain-producers of L-alanine, to study the regulatory mechanisms of the activity and synthesis of key enzymes of L-alanine biosynthesis, and to produce L-alanine by microbiological methods. The initial strain used in this study is Br. flavum AA5 strain-producer that is resistant to DL-α-ABA and auxotrophic to D-alanine. This strain synthesizes up to 43.8 g/l of L-alanine in flask fermentation conditions. To obtain new, more active strain-producers, the activity of key enzymes of L-alanine synthesis was first studied. The results showed that the activity of alanine racemase in the Br. flavum AA5 strain-producer is reduced by almost 99% compared to that in the Br. flavum ATCC 14067 wild-type strain. The influence of some amino acids: D-alanine, L-valine and their structural analogs: DL-α-ABA, L-cycloserine, β-Cl-L-alanine on both alanine and valine–pyruvate transaminases activity in the initial Br. flavum AA5 strain was also studied. The results demonstrated that DL-α-ABA, L-cycloserine and β-Cl-L-alanine inhibited the activity of alanine and valine–pyruvate transaminases in this strain. It is worth mentioning that β-Cl-L-alanine was the strongest inhibitor of alanine transaminase, while L-cycloserine strongly inhibited valine–pyruvate transaminase. This inhibition of the activity of these enzymes served as the basis for obtaining new, highly active strains resistant to these analogs. As a result of genetic selection, strains resistant to β-Cl-L-alanine and to L-cycloserine were selected. The most active strain, resistant to 0.25 mg/ml of L-cycloserine, synthesized up to 45 g/l of L-alanine in flasks on a shaker. While Br. flavum GL1 and GL18 strain-producers, resistant to 0.025 mg/ml and 0.05 mg/ml of β-Cl-L-alanine, synthesized up to 53.7 and 60.5 g /l L-alanine respectively. The cultures were done under optimized fermentation conditions (the composition of fermentation and inoculum media, age of inoculum and aeration conditions) in a medium of the following composition: sucrose – 15%, (NH4)2SO4 – 5.5%, KH2PO4 – 0.1%, MgSO4 – 0.1%, CaCO3 – 5% biotin - 500 μg/l, thiamin - 70 μg /l, D-alanine, 100 μg/ml in 96 hours.

    Item Type: Thesis (PhD)
    Additional Information: Получение высокоактивных штаммов-продуцентов L-аланина и разработка технологии биосинтеза. Obtaining of highly active strain-producers of L-alanine and development of biosynthesis technology.
    Uncontrolled Keywords: Мелконян Лусинэ Оганесовна, Melkonyan Lusine H.
    Subjects: Biology
    Divisions: UNSPECIFIED
    Depositing User: NLA Circ. Dpt.
    Date Deposited: 29 Sep 2016 17:56
    Last Modified: 04 Oct 2016 11:18
    URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/3524

    Actions (login required)

    View Item