Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Bacillus thuringiensis-ի ջրալույծ մելանինի ստացումը, բնութագրումը և փորձարկումը

Ավետիսյան, Սոնա Ոսկանի (2014) Bacillus thuringiensis-ի ջրալույծ մելանինի ստացումը, բնութագրումը և փորձարկումը. PhD thesis, ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ ՊՈԱԿ.

[img] PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (1110Kb)

    Abstract

    В настоящее время исследование и применение биополимеров – высокомолекулярных природных соединений, выполняющих ключевые функции в процессах жизнедеятельности всех живых организмов, является одним из наиболее актуальных направлений фундаментальной и прикладной науки. К числу наиболее часто изучаемых макромолекулярных соединений природного происхождения после белков и нуклеопротеинов относятся углеводные и фенольные биополимеры. Особое место среди природных полимеров занимают меланины. Будучи химически относительно инертными, меланины, в то же время, являются единственными биологическими полимерами со свойствами стабильного свободного радикала. Характерными особенностями меланинов являются наличие высокостабильных парамагнитных центров, разнообразных функциональных групп, а также системы сопряженных связей в их молекулах. Эти особенности структуры определяют их фото и радиопротекторные, антиоксидантные, а также другие свойства, благодаря которым меланины нашли широкое применение в медицине, фармакологии, косметологии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности. На пути широкого использования меланинов в различных областях существуют некоторые сложности. Производство синтетических меланинов – дорогостоящий процесс. Кроме того, синтетические меланины и большинство природных, выделяемых из различных организмов (растения, микроорганизмы и животные), нерастворимы в воде, что существенно затрудняет приготовление фармакологических и косметических препаратов на их основе. Известные в литературе штаммы-продуценты меланинов характеризуются низкой активностью, они, в основном, секретируют ДОФА-меланины [Пат. 2278163 РФ, 2006; Пат. 2186105 С2 РФ, 2002]. Описанные в этих работах меланины нерастворимы в воде, имеют внутриклеточную локализацию. Применение меланинов такого типа ограничивается как нерастворимостью их в воде, так и дороговизной процессов выделения и очистки. Крайне ограничены литературные данные относительно штаммов-продуцентов водорастворимого бактериального меланина. Известные штаммы-продуценты меланинов имеют низкую активность. Так, рекомбинантный штамм Streptomyces lividans синтезирует 3,3 г/л меланина [Пат. 5814495 США, 1998]. Одной из центральных проблем современной медицинской биотехнологии является получение новых физиологически активных препаратов. В последнее время исследуются возможности использования препаратов, регулирующих каскад процессов, задействованных в регенерации нервной ткани. Как было сказано выше, меланины проявляют протекторные свойства. В связи с этим изучение действия бактериального меланина на регенерацию нервных клеток является важной задачей. Повышение продуктивности сельского хозяйства путем применения возрастающих доз минеральных удобрений и ядохимикатов привело к опасному загрязнению окружающей среды. И на сегодняшний день усилия ученых направлены на применение экологически чистых стимуляторов роста, полученных биотехнологическим путем. Ատենախոսական աշխատանքը նվիրված է միջատասպան ակտիվությամբ օժտված B. thuringiensis-ի մելանին սինթեզող բարձրակտիվ շտամների ստացմանը, ջրալույծ բակտերալ մելանինի բնութագրմանը և դրա կենսաբանական ակտիվության ուսումնասիրությանը: B. thuringiensis շտամների մոտ ՆԳ և ՈւՄ ինդուկցված մուտանտներ ստանալու փորձերում հայտնաբերվել է, որ ստրեպտոմիցին պարունակող լիարժեք միջավայրերի վրա աճած բոլոր գաղութներն օժտված են ագար ներթափանցող մուգ շագանակագույն գույնով: Բազմաթիվ վերացանքսերի արդյունքում ապացուցվել է ստացված պիգմենտ առաջացնող (pig) մուտանտների գենետիկական կայունությունը: Ցույց է տրվել, որ pig մուտանտների կուլտիվացման ընթացքում անջատված պիգմենտն արտաբջջային է: Սինթեզված ջրալույծ պիգմենտի ելքը կազմում է մինչև 5,0 գ/լ: Ստացված պիգմենտի պատկանելությունը մելանիններին ապացուցվել է օքսիդիչներով (H2O2, KMnO4, FeCl3) որակական ռեակցիաների կիրառմամբ: Ցույց է տրվել, որ բակտերիալ մելանինի կազմում պարունակվում է մինչև 25% կապված պեպտիդ, որը հելֆիլտրացիայի պրոցեսում պիգմենտից չի անջատվում: Պարզվել է, որ պիգմենտի ջրալույծ հատկությունը մասնավորապես պայմանավորված է իր կազմում պեպտիդի առկայությամբ, որի քայքայումը բերում է պիգմենտի ջրի մեջ լուծվելու հատկության կորստին: Ստացված բակտերիալ մելանինի մոլեկուլային զանգվածն ըստ SDS PAG էլեկտրոֆորեզի տվյալների կազմում է 3,5-8 կԴա, իսկ հիմնական ֆրակցիայինը՝ մոտ 4,7 կԴա: Դեքստրին-յոդին կոմպլեքսի հետ որակական ռեակցիաների կիրառմամբ հաստատվել է ջրալույծ բակտերալ մելանինի հակաօքսիդանտ հատկությունը: Ուսումնասիրվել է ֆերմենտացիայի պայմանների (pH, ջերմաստիճան, աերացիա) և լիարժեք սննդարար միջավայրի կազմի ազդեցությունը մելանինի սինթեզի վրա: Ցույց է տրվել, որ մելանինի կենսասինթեզի սահմանափակող գործոններն են համարվում աերացիան և ֆերմենտացիոն միջավայրում L-թիրոզինի կոնցենտրացիան: Մշակվել է L-թիրոզինի բարձր պարունակությամբ էժան հումքից բաղկացած լիարժեք սննդարար միջավայրի կազմ: Նշված միջավայրում և ինտենսիվ աերացիայի դեպքում մելանինի ելքը սրվակային ֆերմենտացիայի պայմաններում կազմում է ավելի քան 11 գ/լ: B. thuringiensis մելանինոգեն շտամներում ջրալույծ բակտերիալ մելանինի կենսասինթեզի ուղիների ուսումնասիրության արդյունքում պարզվել է, որ դրանք փորձարկված սուբստրատներից պոլիֆենոլօքսիդազային ակտիվություն են ցուցաբերում միայն L-թիրոզինի և L-ԴՕՖԱ-ի (օրտոֆենոլ) նկատմամբ: Մետա-(ռեզորցին) և պարա-դիֆենոլներն (հիդրոխինոն) օքսիդացնելու անկարողությունը վկայում է թիրոզինազային ակտիվության առկայության մասին: Ծնողական շտամների համեմատ pig մուտանտների մոտ այդ ֆերմենտի ակտիվությունն ավելի քան 4 անգամ բարձր է: The thesis is devoted to the production of highly active melanin-synthesizing strains of B. thuringiensis having insecticidal activity, characteristic of water-soluble bacterial melanin and study of its biological activity. In experiments on obtaining NG- and UV-induced mutants in B. thuringiensis strains it was detected that all colonies grown on streptomycin-containing agar media had deep-brown coloring diffusing into agar. As a result of numerous re-inoculations genetic stability of the produced chromogenic (pig) mutants was proved. The pigment isolated upon cultivation of pig mutants was shown to be extracellular. The yield of synthesized water-soluble pigment was up to 5.0 g/l. The belonging of the produced pigment to melanins was confirmed by qualitative reactions with oxidants (H2O2, KMnO4, FeCl3). It was shown that bacterial melanin contained up to 25% of associated peptide, which in the process of gel-filtration did not separate from the pigment. It was detected that water-soluble property of the pigment was directly connected with the presence of peptide in its composition, the destruction of which led to the loss of water solubility of the pigment. The molecular mass of the obtained bacterial melanin according to the data of SDS-PAG electrophoresis corresponded to 3.5-8 kDa, and the basic fraction was about 4.7 kDa. The antioxidant activity of water-soluble bacterial melanin was established by a qualitative reaction. The influence of fermentation conditions (pH, aeration and temperature) and nutrient medium composition on melanin synthesis was studied. It was shown that aeration and the concentration of L-tyrosine in fermentation medium were limiting factors influencing the activity of a producing strain. The composition of the nutrient medium consisting of inexpensive raw component with high content of tyrosine was developed. In flask fermentation on the mentioned medium and at intensive aeration, the yield of melanin was more than 11 g/l. As a result of study of the routes of water-soluble bacterial melanin biosynthesis in melaninogenic B. thuringiensis strains it was revealed that out of the tested substrates they showed polyphenoloxidase activity only in relation to L-tyrosine and L-DOPA (orthodiphenol). Inability of melaninogenic B. thuringiensis strains to oxidize meta-(resorcinol) and para-diphenols (hydroquinones) proved their tyrosinase activity. The activity of this enzyme in pig mutants was more than fourfold higher as compared to their parent strains. To use melaninogenic strains of B. thuringiensis in agriculture as insecticidal preparation and bacterial melanin as a biostimulator of plants growth, their environmental safety was determined. Study of survival of vegetative cells of pig strain in non-sterile and sterile soils under laboratory conditions showed that the growth of inoculated cells was suppressed by the soil microflora. The results of dynamics of bacterial melanin assimilation in the soil showed that it was quickly enough and efficiently assimilated by soil microorganisms and could not cause contamination of ground waters.

    Item Type: Thesis (PhD)
    Additional Information: Bacillus thuringiensis-ի ջրալույծ մելանինի ստացումը, բնութագրումը և փորձարկումը: Obtaining, characteristic and testing of water-soluble melanin Bacillus thuringiensis.
    Uncontrolled Keywords: Ավետիսյան Սոնա Ոսկանի, Avetisyan Sona
    Subjects: Biology
    Divisions: UNSPECIFIED
    Depositing User: NLA Circ. Dpt.
    Date Deposited: 03 Oct 2016 13:00
    Last Modified: 03 Oct 2016 13:00
    URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/3552

    Actions (login required)

    View Item