Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Բակտերիալ ծագման ռեկոմբինանտ D-հիդանտոինազներ եվ L-ամինաացիլազներ. ստացումը, մաքրումը և կենսաքիմիական բնութագրումը

Ագանյանց, Հովսեփ Ալեքսանդրի (2013) Բակտերիալ ծագման ռեկոմբինանտ D-հիդանտոինազներ եվ L-ամինաացիլազներ. ստացումը, մաքրումը և կենսաքիմիական բնութագրումը. PhD thesis, ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ ՊՈԱԿ.

[img]
Preview
PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (915Kb) | Preview

    Abstract

    В современной биотехнологии особое место занимает производство аминокислот и их производных, входящих в состав различных лекарственных препаратов, биологически активных добавок и других веществ. Традиционно аминокислоты получают микробиологическим и химическим синтезом, гидролизом белков и путем биотрансформации. Биотрансформация позволяет получить аминокислоты, у которых из-за особенностей регуляции их метаболизма создание высокоактивных штаммов-продуцентов является трудно выполняемой задачей. В биокаталитических системах важнейшая роль отводится ферментам-катализаторам. Несмотря на определенные успехи в достижении повышения выхода целевых ферментов, применением генетических и технологических подходов, стоимость ферментных препаратов остается высокой. В настоящее время биотехнологически важные ферментные препараты получают на основе рекомбинантных штаммов. Генно-инженерные технологии позволяют не только увеличить продуктивность штаммов-продуцентов, но и получать ферментные препараты с заданными свойствами. Для ряда ферментов на основе методологии генной инженерии созданы высокоактивные штаммы-продуценты, но высокая концентрация несекретируемых ферментов в клетках рекомбинантных штаммов приводит к их агрегации и образованию так называемых «телец включения», что отражается на конечном выходе активных ферментов. Существующие методы растворения «телец включения» не обладают высокой результативностью. Ферменты, полученные из термофильных микроорганизмов, удобны для использования в биотехнологических процессах. Известные природные штаммы-продуценты L-аминоацилаз и D-гидантоиназ характеризуются низкой активностью. У гипертермофильной Pyrococcus furiosus активность L-аминоацилазы составляет всего 0,34 Ед/мг [Sherry et al., 2001], а у Bacillus circulans уровень удельной активности – 0,1 Ед/мг[Luksa et al., 1997]. Для получения энантиомерно чистых аминокислот наиболее востребованными ферментными препаратами являются аминоацилазы и ферментативная пара гидантоиназа-карбамоилаза. Один и тот же катализатор, созданный на основе этих ферментов, можно применять в биокаталитических процессах получения различных продуктов – оптически активных L- и D-аминокислот и их производных. Несмотря на имеющиеся успехи в создании активных штаммов-продуцентов, пока не решены все проблемы, необходимые для создания эффективных способов получения востребованных ферментных препаратов гидантоиназы и аминоацилазы. При созданнии высокоактивных рекомбинантных штаммов-продуцентов крайне важным является выбор подходящего вектора и использование сильных промоторов для обеспечивания высокой экспрессии генов, контролирующих биосинтез целевых ферментов. Поэтому для осуществления молекулярного клонирования генов, кодирующих синтез гидантоиназы и аминоацилазы, целесообразным является использование системы векторов pET с сильным промотором бактериофага T7 [Глик Б., Пастернак Дж., 2002]. Исходя из вышесказанного, конструирование рекомбинантных высокоактивных штаммов, продуцирующих D-гидантоиназу и L-аминоацилазу, разработка эффективных способов очистки, установление каталитически важных свойств указанных ферментов является актуальным. Հանգուցային բառեր` Geobacillus stearothermophilus, hyd գեն, ռեկոմբինանտ շտամ, D-հիդանտոինազ, L-ամինաացիլազ, ջերմակայունություն, ստերեոսպեցիֆիկություն, իմոբիլիզացիա: Ատենախոսական աշխատանքը նվիրված է հիդանտոինազը կոդավորող գենի ուսումնասիրմանը, D-հիդանտոինազային և L-ամինաացիլազային բարձր ակտիվությամբ օժտված ռեկոմբինանտ շտամների կառուցմանը, այդ ֆերմենտների ֆիզիկա-քիմիական և կատալիտիկ բնութագրմանը: G. stearothermophilus ATCC 31783 և ATCC 31195 շտամների ամինաթթվային հաջորդականությունների համեմատությունը բացահայտել է բարձր նմանություն – 96 %: Նշված շտամների հիդանտոինազների առաջնային կառուցվածքները հիմնականում տարբերվում են С-ծայրային տեղամասերով: Տարբեր ծագման 28 հիդանտոինազների ամինաթթվային հաջորդականությունների համեմատական վերլուծությունը թույլ տվեց այդ հաջորդականություններում բացահայտել կոնսերվատիվ տեղամասեր: Հիդանտոինազների առաջնային կառուցվածքների BLAST վերլուծության արդյունքում բացահայտվել է, որ այդ ֆերմենտներն առանձնանում են առանձին ճյուղում և ֆիլոգենետիկորեն ազգակից են տարբեր ծագման դեհիդրոպիրիմիդինազների հետ: G. stearothermophilus ATCC 31195 թերմոֆիլ մանրէում հայտնաբերված են ~330, 210 և 180 հ.ն.զ. չափով երեք, իսկ G. stearothermophilus ATCC 31783 մանրէում ՝ ~350, 210, 170 և 140 հ.ն.զ. չափով չորս բարձրամոլեկուլային պլազմիդներ: Թերմոֆիլ G. stearothermophilus ATCC 31783 և ATCC 31195 մանրէների ամբողջական և պլազմիդային ԴՆԹ-երը NotI, SfiI և SmaI ռեստրիկտազներով մշակումից հետո հիբրիդիզացիոն համեմատական վերլուծությամբ ցույց է տրվել, որ hyd գենը տեղակայված է քրոմոսոմում: Իրականացվել է G. stearothermophilus ATCC 31195 շտամի hyd գենի մոլեկուլային կլոնավորումը վեկտորի վրա՝ սեփական պրոմոտորով: Կառուցվել են pHYDа և pHYDb պլազմիդները կրող շտամներ: Այդ շտամներում հիդանտոինազի առկայությունը վկայում է հետերելոգ ցիտոպլազմային միջավայրում hyd գենի էքսպրեսիայի մասին: Հիդանտոինազի բարձրակտիվ շտամ-արտադրիչի ստացման նպատակով կատարվել է G. stearothermophilus ATCC 31783 շտամի hyd գենի մոլեկուլային կլոնավորումը Т7 բակտերիոֆագի ուժեղ պրոմոտոր կրող վեկտորի կիրառմամբ: Ստացված E. coli BL21 AS (pHYD) նոր՝ D-հիդանտոինազի բարձրակտիվ ռեկոմբինանտ շտամ-արտադրիչում այդ ֆերմենտի ակտիվությունն երկու կարգով գերազանցում է բնական ֆերմենտի ակտիվությանը: Ստացված ռեկոմբինանտ հիդանտոինազը առաջացնում է այսպես կոչված «ներառման մարմնիկներ», որոնց լուծման նպատակով առաջակվել է եղանակ՝ որպես լուծող նյութ N-լաուրիլ սարկոզինատի կիրառմամբ: Առաջարկվել է լուծելի ռեկոմբինանտ հիդանտոինազի մաքրման սխեմա: Մաքրված ֆերմենտի ակտվությունը կազմում է 69 միավոր/մգ: Ֆերմենտի մոլեկալային զանգվածը կազմում է 52 կԴա: Ռեկոմբինանտ հիդանտոինազը մաքսիմալ ակտիվություն է ցուցաբերում pH 8,5-9,0 տիրույթում և 60оС ջերմաստիճանի պայմաններում, 2 մՄ Mn2+ առկայությամբ: Ֆերմենտը պահպանում է ակտիվությունը 20 րոպե մինչև 65оС ինկուբացիայի պայմաններում, ինչը վկայում է ֆերմենտի չափավոր ջերմակայունությունը: Key words: Geobacillus stearothermophilus, hyd gene, recombinant strain, D-hydantoinase, L-aminoacylase, thermostability, stereospecificity, immobilization. The thesis is devoted to the study of the gene encoding hydantoinase, construction of recombinant strains with high hydantoinase and L-aminoacylase activity, and the physico-chemical and catalytic characterization of these enzymes. Comparison of amino acid sequences of hydantoinses of strains G. stearothermophilus ATCC 31783 and ATCC 31195 showed high identity – 96%. The primary structure of these strains differ mainly in the C-terminal end. The comparative analysis of the amino acid sequences of 28 known hydantoinases of different origin allowed us to establish conservative regions in these sequences. According to the results of BLAST analysis of the primary structures of hydantoinases it was revealed that these enzymes form a separate branch and are phylogenetically related to dihydropyrimidinases of different origin. In the thermophilic bacterium G. stearothermophilus ATCC31195 three plasmids were revealed with macromolecular sizes ~ 330, 210 and 180 kb, and in strain G. stearothermophilus ATCC 31783 – four plasmids were revealed with macromolecular sizes ~ 350, 210, 170 and 140 kb. Chromosomal localization of the hyd gene of thermophilic strains G. stearothermophilus ATCC 31783 and ATCC 31195 was shown by comparative hybridization analysis of total and plasmid DNA after treatment with NotI, SfiI and SmaI restriction enzymes. Molecular cloning of hyd gene of G. stearothermophilus ATCC 31195 was carried out on the vector under the control of its own promoter. Recombinant strains carrying plasmids pHYDa and pHYDb, were desitgned. The existence of hydantoinase activity in these strains indicates the hyd gene expression in a heterologous cytoplasmic surrounding. In order to obtain the high-activ hydantoinase strain-producer the molecular cloning of the hyd gene of strain G. stearothermophilus ATCC 31783 was carried out using a vector with a strong promoter of bacteriophage T7. A new recombinant strain of E. coli BL21 AS (pHYD) – producer of D-hydantoinase was designed. The specific activity of recombinant hydantoinase is hundred times as high as the activity of wild-type strain. The obtained recombinant hydantoinase forms so-called "inclusion bodies". In order to dissolve the "inclusion bodies", it was proposed to use N-lauroyl sarcosinate as a solute. A scheme for purification of soluble recombinant hydantoinase was proposed. Specific activity of the purified enzyme was 69 U/mg. The molecular weight of the enzyme is 52 kDa. Recombinant hydantoinase shows maximum activity at the values of pH 8.5-9.0, temperature of 60°C and in presence of 2 mM Mn2+. It is shown that enzyme retains activity when incubated for 20 min at 65oC, showing the moderate thermal stability of the enzyme. Our data indicate that recombinant thermostable hydantoinase has strict D-stereospecificity with respect to 5-(2-methylthioethyl) hydantoin. Determination of the substrate specificity of this enzyme proved that the recombinant D-hydantoinase exhibits high activity with 5-monosubstituted hydantoins of hydrophobic but not aromatic amino acids. Determination of the KM values for some substrates of hydantoinase showed the highest affinity for the DL-5-benzyl hydantoin (0.99 mM).

    Item Type: Thesis (PhD)
    Additional Information: Բակտերիալ ծագման ռեկոմբինանտ D-հիդանտոինազներ եվ L-ամինաացիլազներ. ստացումը, մաքրումը և կենսաքիմիական բնութագրումը:Recombinant d-hydantoinases and l-aminoacylases of bacterial origin: obtaining, purification and biochemical characterization.
    Uncontrolled Keywords: Ագանյանց Հովսեփ Ալեքսանդրի, Aganyants Hovsep
    Subjects: Biology
    Divisions: UNSPECIFIED
    Depositing User: NLA Circ. Dpt.
    Date Deposited: 05 Oct 2016 16:31
    Last Modified: 05 Oct 2016 17:14
    URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/3572

    Actions (login required)

    View Item