Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Escherichia coli-ի հակաօքսիդանտային ակտիվությունը ու L-արգինինի և կրեատինի նյութափոխանակության պատկերը էրլիխի ասցիտային կարցինոմայի ժամանակ

Ավագյան, Հովհաննես Խաչիկի (2015) Escherichia coli-ի հակաօքսիդանտային ակտիվությունը ու L-արգինինի և կրեատինի նյութափոխանակության պատկերը էրլիխի ասցիտային կարցինոմայի ժամանակ. PhD thesis, ԵՊՀ.

[img] PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution.

Download (744Kb)
    [img] PDF (Thesis)
    Available under License Creative Commons Attribution.

    Download (1555Kb)

      Abstract

      Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, рак - одна из основных причин смерти во всем мире, и около 70% всех случаев смерти от него приходится на страны с низким и средним уровнем дохода (ВОЗ/Инф. Бюл.,2012). Число раковых заболеваний и смертность от них продолжают расти, и почти половина онкологических больных не поддается терапии общепринятыми методами (N. Howlader et al., 2013). Злокачественные заболевания сопровождаются иммунодефицитом со снижением противоопухолевого иммунитета и активной малигнизацией клеток, что подтверждается данными о том, что канцерогены подавляют иммунитет (С.А. Куценко, 2003). Иммуностимулирование активирует механизмы врожденной и приобретенной резистентности, препятствуя опухолевому росту в организме, и используется для повышения эффективности онкотерапии (Д.К. Новиков, 2003). На факторы неспецифической резистентности значительное воздействие оказывают иммуностимуляторы, которые входят в состав клеток микроорганизмов (липополисахариды (ЛПС), пептидогликаны, мурамилдипептид, тейхоевые кислоты и др.) и активируют клеточный и гуморальный иммунитет (S. Patyar et al., 2010). Основы микробиальной иммунотерапии рака заложены более ста лет назад: первые вакцины на основе Streptococcus рyogenes и Serratia marcescens успешно использовались для лечения саркомы, карциномы, лимфомы, меланомы и миеломы (S.A. Hoption Cann et al., 2003). К новым штаммам микроорганизмов с антиканцерогенным действием, не оказывающим побочных эффектов, относится представитель облигатной микрофлоры млекопитающих,кишечная палочка (Escherichia coli), которая, будучи грамотрицательной бактерией, содержит ЛПС в качестве структурного компонента клеточной стенки (Jr. Evans еt al., 2007). ЛПС кишечной микробиоты играет важную роль в регуляции иммунного гомеостаза, и его недостаточность сопровождается нарушением системных механизмов функционирования организма с развитием иммунодефицита (М.Ю. Яковлев, 2003). При обработке мышей ЛПС и/или грамотрицательными бактериями такими, как E. coli и пр., происходит выброс активированными макрофагами фактора некроза опухоли с последующим селективным лизисом опухолевых клеток (E.A. Carswell et al., 1975). При асцитной карциноме Эрлиха (АКЭ), показано, что фаго-, и термолизаты E. сoli повышают эффективность антиопухолевого воздействия ряда лекарственных препаратов, удлиняют среднее время выживаемости, порой вплоть до полного излечения (K. Gambashidze et al., 2012). Возможность практического использования Е. сoli в терапии злокачественных опухолей требует многостороннего изучения ее влияния: путей обмена, сопряженных с иммунной защитой организма, энергетические процессы и оксидативный стресс, вовлеченные в патогенез канцерогенеза. Новой перспективной стратегией в лечении рака является регулирование метаболизма L-аргинина, который влияет на активность Т-клеточного иммунитета и препятствует развитию иммунодефицита (M. Munder, 2009). В органах и тканях содержание аргинина в основном лимитируется аргиназой, которая расщепляет его на орнитин и мочевину, и представлена двумя формами: цитоплазматической (А1) и митохондриальной (А2) (V. Bansal, B. Ochoa, 2003; C.P. Jenkinson et al., 1996). Последние работы свидетельствуют об участии этого фермента в механизмах иммуносупрессии и подавлении противоопухолевого ответа (E.C. Hsueh et al., 2012). Аргиназа экспрессируется в опухолевых клеточных линиях, первичных очагах развития рака человека и мышей и участвует в синтезе полиаминов, промотирующих пролиферацию, а также подавляет активность синтазы оксида азота (NOS), и опосредуемую оксидом азота (NO) цитотоксичность в отношение опухоли (S.M. Mumenthaler et al., 2008). Есть и полностью противоположное проявление, когда злокачественные опухоли, проявляющие ауксотрофность по аргинину, успешно лечат аргиназой и ее модифицированными формами (L.G. Feun et al., 2008; K. Morrow et al., 2013). L-аргинин является также субстратом NO синтазы, которая конвертирует его в L-цитруллин и NO, плюрипотентный универсальный биомедиатор, который может оказывать про- и антиканцерогенное действие, альтернативно влияя на пролиферацию клеток, апоптоз, миграцию, инвазию, ангиогенез и другие процессы в биологии рака (A.J. Burke et al., 2013). NO продуцируется в цитоплазме и митохондриях, и его уровень зависит от проявления активности представленных в этих клеточных компартментах основных форм NOS: конститутивные, нейрональная NOS, участвующая в механизмах сигнальной трансдукции, и эндотелиальная NOS, регулирующая кровообращение, и индуцибельная форма (iNOS), эффекторная молекула врожденной иммунной системы (W.K. Alderton et al., 2001). Развитие иммунодефицита при опухолевой агрессии связано с активированием свободнорадикального окисления (СРО) и подавлением антиоксидантной системы (АОС) организма, в которых iNOS принимает непосредственное участие (В.В. Лебедев, 2004; V. Demichelli et al., 2007). Реципрокная регуляция NO синтазы и аргиназы контролирует пул аргинина во всех органах и тканях, в которых они конкурируют за общий субстрат, и их взаимовлияние играет роль в процессах нейро-, и иммунорегуляции (M.J. Mori, 2007). При раке могут коиндуцироваться А1 и iNOS, и они подавляют фунции цитотоксических лимфоцитов, участвуя в процессах иммуносупрессии, вследствие чего рассматриваются в качестве возможных терапевтических мишеней (N. Obermajer еt al., 2012). Вышеуказанные ферменты в зависимости от внутриклеточной локализации и их взаимодействия могут оказывать разное воздействие на процессы малигнизации, на что влияют тип опухоли, стадия ее развития и прочие факторы. Вдобавок большая доля аргинина используется у млекопитающих для синтеза креатина (M.M.Jr. Sidney, 2004). Креатинкиназная система вовлечена в патогенетические процессы при канцерогенезе: она влияет на рост и апоптическую гибель опухолевых клеток, однако вклад митохондриальной и цитоплазматической изоформ креатинкиназы неоднозначен и требует изучения (S. Bera et al., 2008; X.L. Qian et al., 2012). Развитие опухоли определяется не только свойствами злокачественных клеток, но и фенотипом инфильтрующих и взаимодействующих с нею иммунных клеток, которые могут вызывать как деструкцию опухоли, так и стимулирование ее роста, инвазии в окружающие нормальные ткани и метастазирование (C.E. Lewis, J.W. Pollard, 2006). Исследование биохимических сдвигов в лейкоцитах при канцерогенезе, в частности касающиеся путей превращения аргинина, а также возможностей их модулирования при злокачественных опухолях ЖКТ представляют особый интерес, поскольку их прогноз часто неблагоприятен. В основе патофизиологии заболеваний ЖКТ лежит взаимодействие между кишечником, микробиотой и нервной системой (S.M. O’Mahony et al., 2011). Одновременное изучение процессов злокачественного перерождения в брюшной полости и метаболических пертурбаций в ЦНС позволит пролить свет на комплексную патобиохимическую картину канцерогенеза и системные молекулярные механизмы микроботерапии, которые по сей день недостаточно изучены. Հանգուցային բառեր`Escherichia coli, ազոտի օքսիդի սինթազ, արգինազ, բջջապլազմա, գլխուղեղ, Էրլիխի ասցիտային կարցինոմա, լեյկոցիտներ, լիպիդների գերօքսիդացում, կրեատին կինազ, միտոքոնդրիումներ Էրլիխի ասցիտային կարցինոմայի (ԷԱԿ) փոխպատվաստման երկրորդ օրը երկամսյա արու սպիտակ մկների աչքերի ու բերանի խոռոչի միանվագ մշակումը E. coli–ի ոչ պաթոգեն շտամի օգտագործմամբ 75 %-ով երկարացնում է միջին գոյատևման ժամանակը, իսկ փոխպատվաստման 11-րդ օրը 3 անգամ նվազեցնում է ասցիտային հեղուկի ծավալը և արգելակում ԷԱԿ-ինդուկցված լիպիդների գերօքսիդացման (ԼԳ) պրոցեսները՝ իջեցնում մալոնային դիալդեհիդի (ՄԴԱ) մակարդակը և նրա in vitro գոյացման գործընթացը (ոչ ֆերմենտային ԼԳ մոդել) որովայնի և արյան լեյկոցիտների ու գլխուղեղի բջիջների բջջապլազմայի և միտոքոնդրիումների մեջ, և արյան պլազմայում, մեղմելով օքսիդատիվ սթրեսի և իմունային ճնշման գործընթացները: Մինչդեռ, ուռուցքային բջիջներում կրկնակի աճում է ՄԴԱ-ի գոյացումը in vitro պայմաններում, վկայելով իրենց դիմադրողականության նվազման մասին: ԷԱԿ-ի վերջնափուլում առաջին անգամ բացահայտվել է L-արգինինի մակարդակի աճ որովայնի և արյան լեյկոցիտների և գլխուղեղի հյուսվածքների բջջապլազմայի և միտոքոնդրիումների մեջ, ինչպես նաև արյան պլազմայում, որն ուղեկցվում է արգինին-նյութափոխանակող ֆերմենտների՝ ազոտի օքսիդի սինթազի (NOS) և արգինազի իզոձևերի, ակտիվության խթանմամբ: Այդ փոփոխությունները փոխադարձ կապակցված են արգինինի մետաբոլիտների մակարդակի հետ՝ L-օրնիտինի (արգինազի ռեակցիան), L-ցիտրուլինի և NO-ի կայուն միացությունների (NOS-ի ռեակցիան): Արգինինի ներբջջային պարունակության աճը մասնավորապես պայմանավորված է ԷԱԿ-ինդուկցված օքսիդատիվ սթրեսի ժամանակ սպիտակուցների քայքայմամբ, որը կարող է խթանվել արգինինի կողմից՝ սպիտակուցների ետտրանսլացիոն արգինիլացման միջոցով, որին հետևում է նրանց ուբիկվիտինացումը և պրոթեոլիզը: Արգինինի աճը և ԼԳ արգասիքների գոյացման գործընթացները խթանում են արգինազի բջջապլազմային իզոֆերմենտի (А1) և ինդուկցվող NOS-ի ակտիվությունները: Բացահայտվել է արգինազի իզոձևերի անհավասարակշռություն, որը պայմանավորված է արգինինի ներբջջային նյութափոխանակության հյուսվածքային առանձնահատկություններով ԷԱԿ-ի ժամանակ. որովայնի լեյկոցիտներում՝ A1-ի ակտիվությունը գերիշխում է արգինազի միտոքոնդրիումային իզոֆերմենտի (А2) նկատմամբ, իսկ արյան լեյկոցիտներում և գլխուղեղի բջիջներում՝ A2-ի ակտիվությունը գերիշխում է A1-ի նկատմամբ, ինչը անդրադառնում է արգինինի ու նրա մետաբոլիտների մակարդակի և NO-ի գոյացման վրա միտոքոնդրիումներում: NOS-ի գերակտիվությունը ԷԱԿ-ի ժամանակ խթանում է ազատ ռադիկալային օքսիդացման գործընթացը, արգելակում բջիջների հակաօքսիդանտային համակարգը, և կարող է նիտրոզացման եղանակով արգելակել միտոքոնդրիումային կրեատին կինազը (մԿԿ) ակտիվությունը, որի հնգապատիկ անկումը գրանցվել է որովայնի լեյկոցիտներում, նպաստելով կրեատինի արտահոսքի ԷԱԿ-բջիջներ, որոնց մեջ վերջինիս մակարդակը կրկնակի անգամ ավելի բարձր է քան լեյկոցիտներում: Առաջին անգամ բացահայտվել է, որ ԷԱԿ-ի ժամանակ ստամոքսաաղիքաին ուղիարյունգլխուղեղ համակարգում աղիքային ցուպիկը ազդում է L-արգինինի և կրեատինի ներբջջային նյութափոխանակության վրա: Ներմուծված E. coli-ն կենտրոնանում է որովայնում և ուղղակիորեն ազդում է ասցիտային հեղուկում գտնվող ուռուցքային և իմունային բջիջների վրա. որովայնի լեյկոցիտների հոմոգենատներում և բջջապլազմայում նվազում են արգինինի մակարդակը, A1-ի ու A2 ակտիվությունները, կարգավորվում է NOS-ի ակտիվությունը բջջապլազմայում և խափանում NO-միջնորդավորված գործընթացները՝ օքսիդատիվ սթրեսն ու ապոպտոզը, և մԿԿ-ի արգելակումը: E. coli-ի ներմուծումը կարգավորում է մԿԿ-ի ակտիվությունը որովայնի լեյկոցիտներում, կանխարգելում է կրեատինի արտահոսքը ԷԱԿ-բջիջներ, որտեղ նրա մակարդակը ընկնում է հինգ անգամ և երեք անգամ ավելի ցածր է, քան լեյկոցիտներում: Ուռուցքային բջիջներում արգելակվում է արգինազային ակտիվությունը, համապատասխանաբար պոլիամինների սինթեզն ու պրոլիֆերացիան, և խթանվում է NOS-ը, որը կարող է արգելակել հակաօքսիդանտային համակարգը և առաջացնել նիտրոզացման սթրես: Արյան մեջ և գլխուղեղում ԼՊՍ-ը միջնորդավորվում է E. coli-ի ազդեցությունը՝ դրա ապացույցն է արյան լեյկոցիտների բջջապլազմայում А1-ի և NOS-ի և գլխուղեղում արգինազի երկու իզոձևերի և բջջապլազմայի NOS-ի ակտիվության խթանումը: NOS-ի բարձր ակտիվությունը արյան լեյկոցիտներում և գլխուղեղի բջիջներում կնպաստի մանրէի վերացմանը, իսկ արգինազի իզոձևերի բարձր ակտիվությունը նյութափոխանակորեն միտված է կարգավորելու NOS-ի ակտիվությունը: E. coli-ի մշակման արդյունքում արյան լեյկոցիտներում նվազում է А2-ի и NOS-ի ակտիվությունը միտոքոնդրիումներում նպաստելով նրանց ֆունկցիաների կարգավորմանը, իսկ արյան և գլխուղեղի ԿԿ համակարգի խթանումը ուղեկցվում է արյան պլազմայում կրեատինի մակարդակի կարգավորմամբ և ճնշում է ուռուցքի աճը և նվազեցնում ասցիտային հեղուկի ծավալը: E. coli-ի արգելակիչ ազդեցությունը լիպիդների գերօքսիդացման գործընթացի վրա և արգինինի ու կրեատինի ենթաբջջային նյութափոխանակության կարգավորումը որովայնի և արյան լեյկոցիտներում ու գլխուղեղի հյուսվածքներում ԷԱԿ-ի ժամանակ նոր հեռանկարներ են բացում այդ մանրէի հետագա օգտագործման համար չարորակ ուռուցքների ադյուվանտային թերապիայում: Escherichia coli, arginase, brain, creatine kinase, cytoplasm, Ehrlich ascites carcinoma, leukocyte, lipid peroxidation, mitochondria, nitric oxide synthase Two days after Ehrlich ascites carcinoma (EAC) transplantation to two-month-old white male mice they were subjected to a single treatment of the eyes and mouth with non-pathogenic E. coli strain that increases life span by 75 %, and on 11-th day of EAC development decreases thrice the volume of ascitic fluid, and inhibits EAC-induced lipid peroxidation (LP) processes reducing the level of malondialdehyde (MDA) and its in vitro formation (in a non-enzymatic LP model system) in the cytoplasm and mitochondria of the peritoneal and blood leukocytes and brain tissues, as well as in blood plasma. Reduction of free radical oxidation processes could inhibit mechanisms of immunosuppression restoring leucocyte functional activity. Meanwhile, in tumor cells the MDA in vitro formation increased twice pointing to their diminished resistance. For the first time we found an increase in the L-arginine content accompanied by upregulation of nitric oxide synthase (NOS) and arginase in the cytoplasm and mitochondria of peritoneal and blood leukocytes and brain tissues following EAC. The changes were correlated with the levels of L-ornithine (arginase reaction) and NO and L-citrulline (NOS reaction). EAC-induced exacerbation of oxidative stress apparently intensifies intracellular protein degradation that increases the content of arginine, which in turn could stimulate a posttranslational arginylation of proteins, subsequent ubiquitination and proteolysis. Elevated levels of L-arginine and lipid peroxidation products may trigger cytoplasmic isoform of arginase (A1) and inducible NOS. For the first time we revealed the EAC-induced imbalance in the arginase isoforms activity coupled to tissue-specific metabolic pathways at terminal stage of EAC. The A1 activity prevailes over that of arginase mitochondrial isoform (A2) in the peritoneal leukocytes, whereas the A2 activity dominates that of A1 in blood leukocytes and brain tissues influencing arginine and its metabolites content and NO production in mitochondria. EAC-induced upregulation of the NOS may inhibit the antioxidant system and stimulate oxidative stress and contribute also to the five-fold inhibition of mitochondrial creatine kinase (mCK) (through its nitration) in the peritoneal leukocytes facilitating creatine mobilization by the EAC cells in which its level is two-fold higher than that of peritoneal leukocytes. We showed for the first time that in gut-blood-brain axis E. coli treatment is accompanied by changes in the L-arginine and creatine intracellular pathways. After administration E. coli is generally accumulated in the peritoneal cavity and could exert direct effect on the tumor and immune cells localized in the ascitic fluid: the L-arginine levels are reduced in homogenate and cytoplasm of the peritoneal leukocytes, as well as the activities of A1 and A2. Since, the A2 and cytoplasmic NOS activities are normalized this may prevent NO-mediated processes, nitrosative stress, apoptosis, and mCK inhibition. Bacterial treatment stimulates the mKC activity which is restored and even overcomes the norm, and interferes with the creatine outcome from the leukocyte to EAC cells, in which the level of creatine dropped by 5 times and was thrice lower than that of leukocyte. E. coli infection is accompanied by an inhibition of the arginase activity in the tumor cells that may decrease the polyamine synthesis and cells proliferation, concomitantly E. coli-induced activation of the NOS in the EAC-cells may cause detrimental nitrosative stress and suppression of antioxidant system. In blood and brain E. coli effects are mediated by LPS that is suggested by stimulation of the A1 and NOS activities in the cytoplasm of blood leukocytes, as well as those of A1 and A2 isoforms and cytoplasmic NOS in brain. Overactivation of NOS should restrict E. coli dissemination in blood and brain, whereas high arginase activity is metabolically aimed to modulation of the NOS activity. At the same time, E. coli causes a decrease in the A2 and NOS activities in the mitochondria of blood leukocyte contributing to the normalization of their functions, and activates the creatine kinase in the blood leukocyte and brain, preventing creatine outflow from cells and normalizing its level in the blood plasma thereby contributing to.

      Item Type: Thesis (PhD)
      Additional Information: Escherichia coli-ի հակաօքսիդանտային ակտիվությունը ու L-արգինինի և կրեատինի նյութափոխանակության պատկերը էրլիխի ասցիտային կարցինոմայի ժամանակ: Antioxidant activity of escherichia coli and metabolic profile of l-arginine and creatine in ehrlich ascites carcinoma.
      Uncontrolled Keywords: Ավագյան Հովհաննես Խաչիկի, Avagyan Hovhannes Khachiki
      Subjects: Biology
      Divisions: UNSPECIFIED
      Depositing User: NLA Circ. Dpt.
      Date Deposited: 28 Dec 2015 10:39
      Last Modified: 08 Dec 2016 12:24
      URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/585

      Actions (login required)

      View Item