Հայաստանի ատենախոսությունների բաց մատչելիության պահոց = Open Access Repository of the Armenian Electronic Theses and Dissertations (Armenian ETD-OA) = Репозиторий диссертаций Армении открытого доступа

Մայրական կաթից պրոբիոտիկ բակտերիաների անջատումը և բնութագրումը

Դանիելյան, Լուսինե Վազգենի (2017) Մայրական կաթից պրոբիոտիկ բակտերիաների անջատումը և բնութագրումը. PhD thesis, ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ ՊՈԱԿ.

[img] PDF (Abstract)
Available under License Creative Commons Attribution Non-commercial.

Download (1112Kb)
    [img] PDF (Thesis)
    Available under License Creative Commons Attribution Non-commercial.

    Download (2467Kb)

      Abstract

      Կաթնաթթվային բակտերիաները լայնորեն տարածված են մարդու աղեստամոքսային և միզասեռական համակարգերում: Աղիքային միկրոֆլորան կարևոր դեր է խաղում մարդու հումորալ իմունիտետի բարձրացման և հարուցիչների դեմ պայքարի գործում: Համաձայն մինչև վերջերս գոյություն ունեցող կարծիքի, աղիքային միկրոֆլորան ձևավորվում է ինքնաբուխ՝ սննդակարգի, աշխարհագրական, կլիմայական և այլ գործոնների ազդեցության տակ, սկսած մարդու կյանքի առաջին օրերից մինչև հասուն տարիք: Սակայն, ինչպես ցույց տվեցին վերջին հետազոտությունները աղիքային միկրոֆլորայի ձևավորման գործում առաջնային դեր են խաղում մայրական կաթում հայտնաբերված օգտակար մանրէները [Marwa K.S., at all, 2015, Martin V., at all, 2012]: Մայրական կաթի ժամանակավոր միկրոֆլորան սկսվում է ձևավորվել հղիության երրորդ եռամսայակում և անհետանում է լակտացիայի ավարտին: Մայրական կաթի մանրէների գլխավոր աղբյուր է հանդիսանում կնոջ աղիքային միկրոֆլորան, որը կրծքագեղձեր է տեղափոխվում իմունային բջիջների միջոցով, այսպես կոչված անդրկաթնագեղձային անցուղիով [Fernandez L., at al., 2013]: Մայրական կաթի միկրոֆլորայի կազմը կախված է ժառանգականությունից, մոր սննդակարգից, դեղորայքի օգտագործումից, բնակլիմայական պայմաններից, աշխարհագրական դիրքից և այլն [Cabrera-Rubio R.,at al., 2012]: Աշխարհի տարբեր երկրներում հետազոտություններ են տարվում մայրական կաթի միկրոֆլորայի բազմազանության որոշման ուղղությամբ [Federoco L.V., at al. 2007, Perez-Caro F.J., at al. 2007, Martin R., at al., 2012, Federico L.V., at al., 2007, Sinkiewicz G., 2008]: Հայաստանաբնակ կերակրող կանանց մոտ մայրական կաթի այդպիսի հետազոտություններ մինչև այժմ չեն իրագործվել, ինչը շատ հեռանկարային է հղիության շրջանում կրծքում ձևավորվող միկրոֆլորայի վրա ազդելու և հետագայում նորածինների աղեստամոքսային համակարգի միկրոֆլորայի կազմավորման գիտապրակտիկ հայեցակարգի մշակման համար: Հայաստանաբնակ առողջ կանանց մայրական կաթից կաթնաթվային բակտերիաների անջատումը, ուսումնասիրումը, պրոբիոտիկ ներուժ ունեցող շտամների առանձնացումը և հետագայում որպես պրոբիոտիկներ կիրառումը մանկաբուժության և բժշկության մեջ: Խնդիրներն են՝ Հայաստանաբնակ կանանց մայրական կաթի նմուշներից կաթնաթթվային բակտերիաների մաքուր կուլտուրաների անջատումը: Անջատված ԿԹԲ-ների մորֆո-ֆիզիոլոգիական, կուլտուրալ, մետաբոլիկ հատկությունների ուսումնասիրումը և նույնականացումը ըստ Բերջիի բակտերիաների որոշիչի: Ընտրված շտամների մոլեկուլային գենետիկական նույնականացում RAPD ՊՇՌ մեթոդով և ավանդադրումը: Անջատված ԿԹԲ-ների հակամանրէային հատկությունների և հակաբիոտիկների հանդեպ կայունության ուսումնասիրումը: Հեռանկարային ԿԹԲ-ների պրոտեոլիտիկ ակտիվության, աճման և կաթի մակարդման արագության որոշումը: Մայրական կաթի ռեզիդենտ միկրոֆլորայի պահվածքի ուսումնասիրությունը. կրծքում in vivo, կախված լակտացիայի փուլերից և կերակրման ցիլկից կովի կաթում in vitro մայրական կաթում ex vivo Սինբիոտիկներ ստեղծելու նպատակով սինթետիկ և բնական պրեբիոտիկների ազդեցության ուսումնասիրությունը անջատված կաթնաթթվային բակտերիաների աճի և կենսունակության պահպանման վրա: Հաստատվել է հայաստանաբնակ առողջ կանանց կրծքի կաթում պրոբիոտիկ միկրոօրգանիզմների բարձր քանակությունների ~105 ԳԱՄ/մլ առկայությունը: Կրծքի կաթից անջատված միկրոօրգանիզմների մեծամասնությունը համաձայն ֆենոգենետիկական նույնականացման ըստ Բերջիի բակտերիաների որոշիչի և RAPD ՊՇՌ տվյալների իրենցից ներկայացնում են լակտոկոկեր կամ լակտոբացիլներ: Մեր կողմից հետազոտվել է մայրական կաթում ժամանակավոր միկրոբիոտայի քանակական և որակական փոփոխությունները լակտացիայի տարբեր շրջաններում in vivo և ex vivo պայմաններում, որոնց արդյունքում հայտնաբերվել է, որ առողջ կանանց կրծքի կաթում կաթնաթվային բակտերիաները հանդես են գալիս որպես գերակշռող տեսակներ: Առաջին անգամ ցույց է տրվել, որ կրծքի կաթում առկա կաթնաթթվային բակտերիաները, ի տարբերություն կովի կաթի, չեն մակարդում մայրական կաթը, այն դեպքում երբ ex vivo պայմաններում ինտենսիվ բազմանում են գոյացնելով 1011 ԳԱՄ/մլ, երբեմն մեկ, երկու տեսակներից կազմված պոպուլյացիա: Սինբիոտիկ կենսապատրաստուկներ ստեղծելու նպատակով ուսումնասիրվել է լակտուլոզի և բուսական ծագման կամեդների ազդեցությունը մայրական կաթից մեկուսացված լակտոբացիլների աճի վրա: Առաջին անգամ ցույց է տրվել սենեգալյան ակացիայի և ծիրանենու կամեդում մանրէների կողմից յուրացվող (15~20%) և մանրէային բջիջները կոնսերվացնող ֆրակցիաների առկայությունը: Աշխատանքի կիրառական նշանակությունը Առավել բարձր պրոբիոտիկ և տեխնոլոգիական հատկություններով օժտված ԿԹԲ-ների շտամներ պարունակող կենսապատրաստուկները կարելի է օգտագործել հղիության երրորդ եռամսյակում կանանց կրծքագեղձերի գաղութացման համար: Ընտրված շտամները՝ բնական և արհեստական պրեբիոտիկների հետ միաժամանակ, կարելի է կիրառել մանկական սննդում աղիների կենսագործունեության բարելավման և օգտակար միկրոֆլորայի պահպանման նպատակով: Պրոտեոլիտիկ բարձր ակտիվությամբ օժտված շտամների օգտագործումը մանկական կաթնային խառնուրդներում կնպաստի կազեինների յուրացմանը և կնվազեցնի նրանց բացասական ազդեցությունն երեխայի աղեստամոքսային համակարգի գործունեության վրա: Կապը գիտական թեմաների հետ Աշխատանքն իրականացվել է ՀՀ Կրթության և գիտության նախարարության Գիտության պետական կոմիտեի բազային ֆինանսավորման միջոցներով: Հեղինակի անձնական ներդրումն է՝ նմուշառումը, շտամների անջատումը, նրանց մորֆո-ֆիզիոլոգիական, կուլտուրալ և մետաբոլիկ հատկությունների ուսումնասիրումը, անջատված շտամների նույնականացումն ըստ Բերջիի բակտերիաների որոշիչի: Բարձր պրոտեոլիտիկ և հակամանրէային հատկությամբ օժտված շտամների ուսումնասիրումը, նրանց աճման փոխազդեցության որոշումը բուսական և արհեստական պրեբիոտիկների հետ: Աշխատանքին առնչվող գիտական հոդվածների վերլուծությունն և ատենախոսության ձևակերպումը: Հետազոտությունների պլանավորումը, մեթոդների մշակումը, ստացված արդյունքների ամփոփումը կատարվել են գիտական ղեկավար կ.գ.դ. պրոֆեսոր Հ.Գ. Հովհաննիսյանի հետ համատեղ Ատենախոսության արդյունքները զեկուցվել են միջազգային գիտաժողովներում՝ The 2nd International Scientific Conference of Young Researchers on “Contribution of the Young Generation in the Development of Biotechnology”, October 1-4, 2013, Yerevan Armenia, “Trends in Microbiology and Microbial Biotechnology”, International Scientific Workshop, October 5-8, 2014, Yerevan Armenia, III International Scientific Conference of Young Researchers: Dialogues on Science, June 23-26, 2015, The 4nd International Scientific Conference of Young Researchers on “Biotechnology. Science and Practice” September28-30, 2017, Yerevan Armenia, «Կանանց նվաճումները կենսաբանական գիտությունների ոլորտում» II միջազգային գիտաժողով, հոկտեմբերի 10-12, 2017, Երևան, Հայաստան և «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ-ի գիտական խորհուրդի նիստերում: Ատենախոսության արդյունքները հրատարկվել են 5 միջազգային և հանրապետական գիտական ամսագրերում հոդվածների ձևով, 4 միջազգային գիտաժողովների թեզիսների ժողովածուներում: Աշխատանքի իրականացման վայրը Աշխատանքը կատարվել է ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ-ի կաթնաթթվային բակտերիաների և շաքարասնկերի, այժմ՝ սննդի կենսաանվտանգության լաբորատորիայում, իսկ մոլեկուլային գենատիպավորումը Ստանդարտ դիալոգ ընկերությունում: Ключевые слова: микрофлора материнского молока, фенотипическая и молекулярная идентификация, пробиотики, in vivo и ex vivo, пребиотики, растительные камеди. Впервые изучена микрофлора молока здоровых армянских женщин. Из молока 23-х женщин-добровольцев, с соблюдением всех правил асептики и стерильности, были взяты пробы и в течение одного часа доставлены в лабораторию. Сразу из десятикратных разведений грудного молока были сделаны засевы в растопленные (46 °C) селективные (MRS) и полноценные агаризованные среды методом заливки в чашки. Кроме этого были сделаны разведения в стерильном обезжиренном коровьем молоке. Титр микроорганизмов, который подсчитывался по количеству колоний, выросших на агаризованных средах, и количеству разведений, ферментировавших молоко, оказался примерно одинаковым, что свидетельствовало о принадлежности микроорганизмов грудного молока к кокковидным или палочковидным представителям отряда Lactobacillales. Титр бактерий в молозиве составил 104-5, в переходном молоке 103-4, а в зрелом 102-3 КОЕ/мл. Случайным методом отобранные колонии ферментировали коровье молоко и состояли из грамположительных кокковидных или палочковидных бактерий в соотношении 3: 2, соответственно. Выделенные чистые культуры 8-и лактобацилл и 12-и лактококков были фенотипически идентифицированы согласно «Определителю бактерий Берги». Оказалось, что микрофлора грудного молока армянских женщин состоит из Lactococcus lactis ssp. (30%), Streptococcus thermophilus (20%), Lactococcus raffinolactis (5%), Lactococcus cremoris (5%), Lactobaccilus casei ssp. (20%), Lactobacillus delbrueckii (5%), Lactobacillus fermentum (5%), Lactobacillus salivarius (5%) и Lactobacillus reuteri (5%). Проведенная фенотипическая идентификация выделенных штаммов была подтверждена RAPD PCR молекулярным тестированием фрагментов ДНК. Изучение пробиотических свойств выделенных из материнского молока штаммов МКБ показало, что их подавляющее большинство обладает высокой антибактериальной и антигрибковой активностью. МКБ, которые эффективно сквашивали коровье молоко, обладали высокой протеолитической активностью. Наличие таких штаммов в детском кишечнике будет способствовать лучшему усвоению белков, особенно при подкармливании детскими смесями, приготовленными на основе коровьего молока. Проведенные эксперименты показали, что МКБ, обитающие в материнском молоке, обладают высокой скоростью роста и накоплением биомассы, что дает им определенные преимущества для успешной колонизации кишечника младенца. Была показана высокая устойчивость МКБ к различным антибиотикам, что является залогом их выживания при применении антибиотической терапии как у ребенка, так и у матери в период беременности и грудного кормления. Key words: human milk microbiome, phenotypic and molecular identification, probiotics, in vivo and ex vivo study, prebiotics, plant gums. The milk microflora of healthy Armenian women was studied for the first time. From the breast milk of 23 women volunteers observing all the rules of aseptics and sterility, samples were taken and within one hour delivered to the laboratory. Immediately tenfold dilutions were inoculated into the melted (46°C) selective MRS and nutrition agars by the cup pouring method. Besides, there were delutions in sterile skimmed cow milk. The titer of microorganisms, determined by the number of colonies formed in the agar media and the number of dilutions fermenting milk, was approximately the same indicating belonging of breast milk microorganisms to the coccoid or rod-shaped representatives of the Lactobacillales order. The titer of bacteria in colostrum was 104-5, in transitional milk103-4, and in mature milk 102-3 CFU/ml. Randomly selected colonies fermented cow milk and consisted of gram-positive coccoid or rod-shaped bacteria in a ratio of 3: 2. The isolated 8 lactobacilli and 12 lactococci pure cultures were phenotypically identified according to the Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. The microflora of breast milk of Armenian women consisted of Lactococcus lactis ssp. (30%), Streptococcus thermophilus (20%), Lactococcus raffinolactis (5%), Lactococcus cremoris (5%), Lactobaccilus casei ssp. (20%), Lactobacillus delbrueckii (5%), Lactobacillus fermentum (5%), Lactobacillus salivarius (5%) and Lactobacillus reuteri (5%). The phenotypic identification of isolated strains was confirmed by RAPD PCR molecular testing of their DNA fragments. The study of the probiotic properties of strains isolated from mother's milk showed that their majority possessed high antibacterial and antifungal activity. LAB, which effectively fermented cow milk, had also high proteolytic activity. The presence of such strains in the infant's intestine will contribute to better assimilation of proteins, especially when fed with infant formulas prepared on the basis of cow milk. Experiments have shown that LAB that live in human milk have high growth rate and biomass accumulation, which give them certain advantages for successful colonization of the baby’s intestine. High resistance of LAB to various antibiotics was shown, which is important for their survival in case of antibiotic therapy in both the baby and the mother during pregnancy and breastfeeding. The variability of the resident microorganisms population in mature breast milk was studied in vivo, depending on the duration of the breaks between feedings. It was found that with usual 3-4 hour breaks before feeding, the cell titer averages 103 CFU/ml; immediately after feeding, the titer drops by one log, then it is restored until the next feeding. With 12-hour abstinence from feeding the titre of cells can reach 104 CFU / ml, but no more. Interesting dynamics of the change in the population of resident microorganisms was found in breast milk outside the body. We showed for the first time in ex vivo experiments that when the intact milk was incubated at 37°C, a rapid growth of microorganisms took place and within 24 hours the titer reached 1011 CFU/ml. At the same time, all dilutions up to the eleventh curdled cow milk forming thick curds. This shows that the final population of the mother's milk culture consists mainly of lactic acid bacteria. Even with such a huge titer of LAB, mother's milk does not curdle - only small white flakes are noticeable.

      Item Type: Thesis (PhD)
      Additional Information: Выделение и характеристика пробиотических бактерий из материнского молока. Isolation and characterization of probiotics from breast milk.
      Uncontrolled Keywords: Даниелян Лусине Вазгеновна, Danielyan Lusine V.
      Subjects: Biology
      Divisions: UNSPECIFIED
      Depositing User: NLA Circ. Dpt.
      Date Deposited: 27 Feb 2018 10:49
      Last Modified: 21 Jun 2018 12:17
      URI: http://etd.asj-oa.am/id/eprint/6790

      Actions (login required)

      View Item